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目标1.验证假说:基于神经血管单元的组成中存在不同的细胞成分,水通道蛋白-4可能在缺血性脑水肿中发挥不同的作用。2.验证假说:水通道蛋白-4可能是缺血/缺氧后成人神经再生的关键蛋白。3.验证假说:在缺血/缺氧后,小凹蛋白-1可能调节基质金属蛋白酶在脑微血管内皮细胞的表达。4.验证假说:小凹蛋白-1可能是脑缺血/再灌注损伤过程中一个关键的蛋白质,与一氧化氮诱导的基质金属蛋白酶活化、紧密连接相关蛋白的降解和继发的血脑屏障的破坏有关。方法1.免疫印迹法检测bEnd.3细胞株水通道蛋白-4的表达;免疫印迹法检测缺血/再灌注6 h,24 h和48 h分离的脑微血管水通道蛋白-4的表达;免疫印迹法检测缺氧缺糖损伤后培养的星形胶质细胞水通道蛋白-4表达。2.免疫印迹法检测常氧及缺氧条件下培养的神经于细胞水通道蛋白-4的表达;在应用针对水通道蛋白-4的特异性小分子干扰RNA处理后的神经干细胞,免疫印迹法检测水通道蛋白-4和神经元βⅢ型微管蛋白的表达。3.在分离的缺血/再灌注损伤的脑微血管,免疫印迹法检测小凹蛋白-1、基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的表达;免疫荧光检测缺血/再灌注损伤后脑微血管小凹蛋白-1的表达;原位明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶-2/-9活性;在应用针对小凹蛋白-1的特异性小分子干扰RNA处理后,体外明胶酶谱法检测原代培养的脑血管内皮细胞基质金属蛋白酶-2的活性。4.将大鼠分为以下组别,每组4~6只大鼠:对照组;缺血2h/再灌注24h组;缺血/再灌注+3mg/kg N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)组;缺血/再灌注+25mg/kg 7-硝基-吲唑组。所有一氧化氮合酶抑制剂均在缺血前15min经腹腔给药。对照组给予同等剂量的生理盐水。伊文思蓝荧光法测定血脑屏障通透性。免疫印迹法检测分离的脑微血管小凹蛋白1的表达;免疫荧光法测定3-硝基酪氨酸、小凹蛋白-1、闭锁小带蛋白-1的表达;原位明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶活性。结果1.在鼠大脑微血管内皮细胞株bEnd.3观察到水通道蛋白-4的表达。与对照组比较,在分离的脑微血管内皮细胞6h,24h和48h缺血/再灌注组水通道蛋白-4表达水平增加。与对照组比较,缺氧缺糖损伤组培养的大鼠星形胶质细胞水通道蛋白-4表达下降。2.常氧和缺氧条件下培养的神经干细胞,水通道蛋白-4的表达至14d天仍有增加。与对照组相比,敲弱水通道蛋白-4可下调神经元βⅢ型微管蛋白表达。3.在分离的脑微血管内皮细胞,基质金属蛋白酶-2的表达在缺血/再灌注6h就明显升高,而基质金属蛋白酶-9在缺血/再灌注损伤48h时显著增加。与假手术组比较,缺血/再灌注损伤后基质金属蛋白酶活性明显增加。在分离的脑微血管内皮细胞,缺血/再灌注损伤6h,24h和48h,小凹蛋白-1表达下降。缺血/再灌注组的小凹蛋白-1阳性微血管数减少。与对照组比较,特异性小分子干扰RNA干预后1天小凹蛋白-1表达水平下降。体外明胶酶谱法检测,小凹蛋白-1敲弱脑微血管内皮细胞的培养基中基质金属蛋白酶的活性增加。4. L-NAME7-硝基-吲唑均可使血脑屏障通透性降低。与生理盐水组比较,在接受L-NAME处理后的脑微血管内皮细胞,小凹蛋白-1表达水平得到恢复。与对照组比较,用L-NAME处理后的缺血/再灌注24h组硝化作用被完全阻断。与对照组比较,L-NAME的处理可以恢复小凹蛋白-1阳性微血管,降低基质金属蛋白酶活性,恢复闭锁小带蛋白-1阳性血管至正常水平。结论1.存在于脑微血管的水通道蛋白-4可能促进缺血性中风早期脑水肿,神经胶质细胞水通道蛋白-4的暂时丧失可能对缺血后脑水肿的形成具有保护作用。2.水通道蛋白-4可能在调节缺血中风后成年神经再生方面发挥重要作用。3.小凹蛋白-1可能是与脑缺血/再灌注损伤后基质金属蛋白酶的活化和血脑屏障破坏有关的一个关键蛋白质。4.在缺血/再灌注的脑微血管内皮细胞和脑组织,小凹蛋白-1可以通过保护紧密连接相关蛋白免于被一氧化氮诱导的基质金属蛋白酶激活而降解,从而控制血脑屏障通透性。