第一章RTN4B促血管新生生物学活性的鉴定肿瘤血管新生对于肿瘤生长,侵袭和转移具有非常重要的意义。了解肿瘤血管新生的调节规律是我们认识肿瘤发生机制的重要一环,对临床肿瘤预防与治疗的具有重要的指导作用。RTN4B是我室于1998年首先克隆的一个人类新基因,前期的工作已经发现:1)正常组织中RTN4B在肝脏之外的其他组织广谱表达,但是在肝癌中,RTN4B的mRNA水平和蛋白水平都显著上调表达;2)过表达RTN4B可以显著提高肝癌细胞株的成瘤性,并能增加瘤块内的血管密度:3)敲减肝癌细胞株中内源RTN4B的表达可以有效抑制裸鼠荷瘤的生长,且瘤体的血管密度也显著减少。这些结果均提示RTN4B很可能是肝癌发生发展过程中一个潜在的功能性血管新生因子。在上述工作的基础之上,本文首先利用多种经典的细胞学实验对RTN4B蛋白进行了促血管新生的活性检测。我们发现,哺乳动物细胞表达的RTN4B蛋白既可以分泌到细胞外培养基中,也存在于细胞外基底膜内。利用体外培养的原代血管内皮细胞,我们分别证明了真核表达的RTN4B蛋白具有显著的促进细胞黏附,伸展和迁移的生物学功能。在RTN4B蛋白的诱导下,重新贴壁生长的内皮细胞发生微丝骨架重构,形成黏着斑复合物,引起细胞内FAK的磷酸化,激活下游的ERK和Akt等通路。为了揭示RTN4B促血管新生的分子机制,我们进一步筛选了RTN4B在内皮细胞表面的作用受体。反向的抗体封阻试验提示RTN4B的促血管新生是整合素α_νβ₃依赖性的;稳定表达整合素α_νβ₃的CHO细胞在RTN4B表面的粘附力大大提高;ELISA试验证明RTN4B和整合素α_νβ₃有直接互作关系。这些新的发现强烈提示,整合素α_νβ₃很可能是RTN4B蛋白在内皮细胞上的一种功能性受体。我们的这项研究揭示了RTN4B具有促血管新生的生物学特性,提示了RTN4B在肝癌发生发展中的重要作用。RTN4B功能性受体的成功鉴定为封阻RTN4B的生物学功能找到了有效靶点,也为设计新的肝癌治疗方法提供了重要的实验依据。第二章整合素β₃在肝癌中的功能研究整合素家族不仅在胚胎发育,血管重建中有重要作用,而且参与了多种肿瘤的发生发展过程。整合素蛋白的表达水平和分布空间在肿瘤发展的过程中都有显著变化,而且越来越多的功能实验证明整合素参与了调控肿瘤细胞的存活,增殖和迁移等事件。但是,至今肿瘤相关整合素的知识还非常有限,不同整合素分子在不同类型的肿瘤中扮演的角色常不尽相同。特别是整合素β₃在肝癌发生过程中的作用迄今未有报道,探索整合素β₃在肝癌中的表达变化和生理学功能对于全面认识肝癌发生发展的机制是十分必要的。利用实时定量PCR和WB实验,我们首先发现整合素β₃在肝癌组织中显著下调表达,在多株肝癌细胞中几乎没有表达。然而,过表达外源整合素β₃能够显著提高多种肝癌细胞株（SMMC-7721,SK-Hepl,QGY-7703）的凋亡水平,抑制克隆形成率。我们构建的稳定表达低水平整合素β₃的SMMC-7721细胞株,尽管在正常培养条件下细胞的凋亡水平仅有小幅度变化,细胞生长速率也几乎不变,但是当我们用撤除血清或剥离细胞外基质（脱巢）的方法诱导细胞凋亡时,稳定表达整合素β₃的SMMC-7721细胞株的凋亡水平会显著高于对照细胞,并能激活Caspase 8的剪切。此外,我们还发现了整合素β₃的配体是调控整合素表达变化和生物学作用的关键因素。肝癌中的两种整合素β₃的天然配体,玻连蛋白（vitronectin,VN）和纤维蛋白原（fibrinogen,FG）不仅出现了显著下调表达,而且和整合素β₃的表达变化相关联。此外,当我们将一定量的配体蛋白添加到无血清培养基中,这些配体蛋白可以成功挽救由于血清撤除造成的细胞凋亡,Caspase 8的剪切也相应降低。类似的实验我们还在SK-Hepl细胞中进行了重复,并得到了一致的结果。这项研究提示整合素β₃及其配体蛋白的显著下调表达对肝癌发生发展具有一定的推动作用,而调整整合素β₃表达水平的方法将为设计肝癌的治疗方案提供新的知识。