慢病毒介导Neurogenin2基因转染骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑缺血的实验研究

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研究背景及目的骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs),来源于骨髓的非造血干细胞,是中胚层发育的早期间质干细胞,具有很强的自我更新和多向分化潜能,在体外适宜条件下可以跨胚层分化为神经细胞。MSCs移植治疗对于脑梗死等中枢神经系统损伤性疾病有一定的疗效,但是MSCs移植入大鼠大脑后存活时间较短,且在体内定向分化为功能神经细胞的效率低,其治疗机制主要在于MSCs旁分泌神经营养因子的作用。碱性螺旋-环-螺旋型蛋白质basic helix–loop–helix (bHLH)是一类在体发育过程中在中枢及外周神经中都有表达的转录因子家族,它们在胚胎发育过程中促进神经细胞的分化。本研究尝试将bHLH家族分子中对于神经元细胞分化起关键作用的Neurogenin2(Ngn2)基因通过慢病毒载体转染入大鼠骨髓间充质干细胞,观察Ngn2基因在体外非诱导条件下对于骨髓间充质干细胞向神经元定向分化的作用,并在体研究Ngn2转染的MSCs植入大脑中动脉缺血的大鼠纹状体后在体内向神经细胞分化、修复缺血损伤以及促进神经功能恢复的作用。研究方法1,利用慢病毒载体系统将Ngn2基因转染入大鼠骨髓间充质干细胞,通过免疫荧光及Western blot实验研究Ngn2基因在MSCs中稳定表达情况。2,通过免疫荧光方法研究转染Ngn2的MSCs在体外非诱导条件下向神经细胞的定向分化。3,通过立体定位技术将Ngn2-MSCs移植入大脑中动脉缺血模型的大鼠大脑纹状体内,通过免疫荧光观察移植细胞在大鼠体内存活、迁移、分化情况。4,通过TTC染色和TUNEL染色研究大鼠大脑梗死体积的变化和缺血灶附近皮质区域细胞凋亡变化,采用改良神经功能损伤评分表(mNSS)来定量评价大鼠MCAO后第2天,即细胞移植前一天,以及Ngn2-MSCs移植治疗MCAO后的第2、4、6、8周神经功能的动态变化。研究结果1,目的基因Ngn2能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞大鼠骨髓间充质干细胞并达到稳定的表达。2,Ngn2-MSCs在体外非诱导条件下能跨胚层向神经细胞定向分化并表达神经细胞特异性标志物。3,Ngn2-MSCs在大脑缺血大鼠脑内可以存活,向缺血半暗区、皮质区域迁移,并且在体内表达神经细胞特异性标志物。4,移植Ngn2-MSCs的实验组大鼠的运动功能、脑梗死体积、皮质区域细胞凋亡的减少数明显优于移植空载病毒转染组(GFP-MSCs)。研究结论1,稳定表达Ngn2基因的大鼠骨髓间充质干细胞可以在体外非诱导条件下向神经细胞定向分化。2,移植稳定表达Ngn2基因的大鼠骨髓间充质干细胞可以促进脑梗死区神经修复和功能恢复。
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