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喹乙醇(Olaquindox)属喹噁啉-1,4-二氧化物,作为一种抗菌饲料添加剂,用来治疗动物细菌性感染和促进动物生长。喹乙醇已被证明具有遗传毒性,且已被部分国家和地区禁止使用,我国也于2017年禁止喹乙醇作为饲料添加剂使用。但是,由于其生产成本低、抗菌促生长效果良好,现还在我国养殖业非法使用,并且其毒性分子机制仍不清楚,对人类健康构成严重威胁。本文以小鼠与人肝癌HepG2细胞为模型,对喹乙醇诱导的肝毒性及细胞凋亡和周期阻滞过程中的信号转导通路进行研究,并对姜黄素降低喹乙醇毒性作用的机制进行初探。本文研究结果分为下列五个部分:(1)本研究成功建立喹乙醇小鼠模型,用三个浓度(100、200和400 mg/kg)喹乙醇连续灌胃28天,证明喹乙醇能明显诱导小鼠肝氧化应激与线粒体损伤,且具有一定的剂量依赖性,证实了喹乙醇诱导小鼠肝损伤通过激活线粒体凋亡通路,激活p53/GADD45a/p21、Nrf2/HO-1、AKT、NF-kB、MAPK等信号通路及自噬通路。(2)本研究成功建立了 GADD45a低表达稳定转染细胞系,证明了 GADD45a可以调控喹乙醇诱导的ROS产生和线粒体凋亡通路。干扰GADD45a基因后,增加喹乙醇诱导的细胞凋亡和DNA损伤,且进一步激活JNK/p38通路。JNK抑制剂(SP600125)和p38抑制剂(SB203580)抑制JNK/p38通路后,显著抑制GADD45a的激活,同时增加喹乙醇诱导的细胞凋亡、DNA损伤和S期阻滞,表明JNK/p38通路在喹乙醇诱导的细胞凋亡中具有保护作用,证实了 JNK/p38通路部分参与了 GADD45a调控的喹乙醇诱导的细胞凋亡和S期阻滞。(3)本研究成功建立p21低表达稳定转染细胞系,证实了喹乙醇通过p53非依懒性方式抑制p21蛋白表达,AKT可以使p21磷酸化,并且诱导p21蛋白从细胞核转移到胞浆中,发挥抗凋亡的作用。喹乙醇通过激活AKT和Nrf2/HO-1信号通路参与诱导HepG2细胞线粒体凋亡和S期阻滞,进一步验证了小鼠试验结果。PI3K/AKT抑制剂(LY294002)和Nrf2/HO-1抑制剂(ZnPP-IX)抑制AKT通路和HO-1信号通路后,增加喹乙醇诱导的细胞凋亡和周期阻滞,表明AKT和Nrf2/HO-1信号通路的抑制发挥促凋亡的作用。干扰p21基因后通过进一步激活AKT通路、抑制Nrf2/HO-1信号通路,增加喹乙醇诱导的线粒体凋亡和S期阻滞。(4)喹乙醇诱导细胞毒性调控中GADD45a和p21调控方式主要是p53非依赖性的。进一步研究证实,p53在喹乙醇诱导的毒性中具有促凋亡的作用,p53基因缺失后减少喹乙醇诱导的线粒体凋亡,使用p53基因缺失小鼠模型进一步验证了 p53的促凋亡作用。p53可能是通过抑制自噬通路,激活JNK/p38信号通路发挥它的促凋亡作用。(5)小鼠与细胞模型证明,姜黄素明显降低喹乙醇诱导的氧化应激与细胞内ROS水平、caspase激活及细胞凋亡。姜黄素通过上调Nrf2/HO-1通路,下调NF-kB通路及抑制NF-kB核转位增强其抗氧化能力。进一步研究证实,姜黄素通过激活Nrf2/HO-1通路,抑制NF-kB、p53通路保护喹乙醇诱导的线粒体凋亡,从而改善喹乙醇诱导的肝损伤。综上所述,本研究从体内和体外评价喹乙醇的毒性,证实GADD45a和p21通过p53非依赖性调控喹乙醇诱导细胞凋亡与周期阻滞,同时JNK/p38、AKT及Nrf2/HO-1通路参与调控喹乙醇诱导细胞凋亡与周期阻滞。本研究为评估喹乙醇及其他喹噁啉类药物对食品动物和人的安全性提供科学依据。