中国柑橘黄龙病发生动态及其病原菌亚洲种群分化研究

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柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing, HLB)是一种严重威胁柑橘产业的毁灭性病害,目前已在亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的近50个国家和地区发生,中国19个柑橘主产省(市、自治区)中已有11个遭受黄龙病为害,柑橘黄龙病已成为制约柑橘产业健康发展的关键因素之一。近年来,随着全球气候变暖,黄龙病的媒介昆虫分布区域逐步扩大,同时种质资源的频繁调运,致使黄龙病危害日趋严重。柑橘黄龙病症状最早在18世纪在印度中部地区有记录,其传播媒介柑橘木虱最早于1927年在印度尼西亚旁遮普地区被发现。我国最早于1919年在广东潮汕地区发现该病,并于上世纪70年代确定柑橘木虱是其传播媒介。柑橘黄龙病病原属暂定的韧皮部杆菌属(Candidatus Liberibacter),根据病原在16S rDNA及β-操纵子基因序列上的差异,将其分为3个种:亚洲种(’Ca. L. asiaticus’)、非洲种(‘Ca.L. africanus’)和美洲种(’Ca. L. americanus’)。其中,亚洲种和美洲种由亚洲柑橘木虱(Diaphorina citri)传播,非洲种由非洲柑橘木虱(Trioza erytreae)传播。柑橘黄龙病菌尚未获得纯培养。因此,对其生物学、生理生化特性知之甚少。对病害的治理也尚无特效药剂及抗(耐)病品种,因此田间主要通过使用无病苗木、及时挖除病树及防治柑橘木虱等方法对病害进行防控。对柑橘黄龙病发生、发展动态的研究,将有助于了解病害的起源、流行趋势以及病原菌种群特性等。因此,梳理中国柑橘黄龙病各病区病害的发生发展历史是十分必要的。在国内尚未对中国柑橘黄龙病发展史进行较为详尽统计的背景下,本学位论文在国家公益性行业(农业)科研专项(200903004-06;201003067-02)的资助下,通过广泛、系统地收集中国柑橘黄龙病从发生至今的病情报道、科研动态等历史文献,初步明确了柑橘黄龙病在中国11个省(自治区)的发生发展动态及引起各地病害发生的可能原因;同时,通过在柑橘黄龙病菌亚洲种(’Ca. L. asiaticus’)全基因组上报道的3个靶标位点对中国不同来源的种群进行了多态性评估,在分子水平上进一步探索了病害的起源及流行。本研究旨在明确中国各地黄龙病的发生动态,并结合对各地病原菌亚洲种群特性的分析进一步探讨病害的起源及流行过程,以期为病害的科学认识及防控提供有力的证据。本研究主要取得了如下研究成果:1、以中国柑橘黄龙病从发生至今的病情报道、科研动态等历史文献资料为研究材料,经整理分析,初步明确了中国柑橘黄龙病各发病省(自治区)病害发生发展动态及引起病害蔓延的原因,据此将各病区HLB的进入途径大致分为两种类型:一类是由于苗木调运引起HLB发生的病区,一类是本身就可能为HLB的起源中心,并对这一分类的依据进行了阐释,提出了中国可能存在柑橘黄龙病多个起源中心的论点。2、选用两个已报道的具有种群多态性的噬菌体相关位点(CLIBASIA05620、 CLIBASIA05538),对来自中国八个黄龙病区的232份’Ca. L. asiaticus’阳性样品进行了种群分化评估。通过分析这两个位点的常规PCR扩增结果表明,中国种群内高海拔地区(特别是云南、四川)与低海拔地区’Ca. L. asiaticus’扩增频率明显不同,通过这两个位点序列比对及构建进化树发现,高、低海拔地区种群分别与最近报道的两种噬菌体SC1和SC2存在相关性。此外还发现,各病区种群内部(特别在云南、四川)亦存在扩增结果多态性,高海拔地区’Ca.L. asiaticus’株系存在高度的多样性与特殊性。3、运用已报道的一个原噬菌体区域高度嵌合位点CLIBASIA05640-CLIBASIA05650(推断的噬菌体转移酶基因)对来自中国8个黄龙病病区的207份’Ca. L. asiaticus’阳性样品进行了病原菌多态性研究。结果显示,样品共产生3种大小不同的扩增子,序列分析表明所有扩增子享有同一序列骨架,其差异是由在非编码区内序列的插入和缺失所致。序列比对及扩增电泳类型分布分析表明,云南、四川等高海拔地区种群与其他低海拔地区种群相比,株系更为复杂,且原噬菌体活性更为丰富。综上所述,本研究结合历史文献追踪及分子生物学技术,表明中国’Ca. L. asiaticus’存在高度的多样性,中国柑橘黄龙病可能存在多个起源中心,或在扩散蔓延的过程中不同地区及不同生境的种群出现了分化。
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