转基因大麦的gfp基因遗传表达及整合位点结构

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转基因在植物中稳定遗传表达是转基因成功运用的关键。本实验利用采用基因枪法获得的转gfp基因大麦为材料,从高度表达到不表达的4种转绿色荧光蛋白基因(gfp)大麦,分别编码为F、C、A和D(D为转基因沉默株系),通过荧光原位杂交明确了gfp在4种不同表达水平转基因大麦中的染色体上的插入位置:4个株系的gfp在7号染色体的不同位置都有一个插入位点,F则在5号染色体还有另外一个插入位点。gfp的不同插入位置使得其的表达量有差异,这体现了gfp转基因的位置效应。 不同转基因植株间进行有性杂交,即F与A、C、D和CK(未转gfp基因的大麦)进行正反交。对亲本、F1和F2代植株的根尖和花粉荧光进行测量,结果表明:4对正反交植株的根尖与花粉荧光表达一致,表明转基因(gfp)是完全核遗传。8个组合中有6个组合的根尖、花粉是可以稳定遗传的,并符合两个独立位点(基因)的分离比,而有2个组合表现出不稳定遗传现象。 对其中的两个gfp表达量差异较大的转基因株系(D和F)进行Soutllem B10t分析,结果发现它们都有一条与转化质粒相近的带,表明它们都由多拷贝的质粒头尾串联整合而成。另外,还对D和F株系进行质粒拯救法分析,不同单酶切后连接,分别都获得了多个拯救质粒,电泳结果表明它们都一样大小;PCR鉴定它们都含有gfp基因。测序分析表明,几个营救质粒中除个别发生截短现象,其他营救质粒都与转化质粒大小一致,序列比对也完全一致,这也进一步说明了转化质粒在植株D和F的基因组中是以头尾相串联的方式进行整合的,确切的转基因拷贝数还不清楚。
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