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肝癌是世界第五大恶性肿瘤,由于缺乏有效的治疗手段,导致其死亡率高居所有癌症的第二位。肝切除和肝移植是治疗肝癌的首选方法,对于不能手术切除或肿瘤转移的病人,通常采用化疗和放疗的治疗方法。到目前为止,索拉非尼是唯一被证实可显著延长晚期肝癌患者总生存期的药物。但是,长期服用索拉非尼,容易引起耐药和肿瘤复发,且高昂的治疗费用给肝癌患者及其家庭带来沉重的负担。因此,迫切需要开发新型的抗肝癌药物。前期,课题组从天然产物库中筛选出特异性杀伤肝癌细胞的天然小分子化合物鸦胆子苦素D。体外实验证实鸦胆子苦素D可以剂量和时间依赖性的抑制肝癌细胞Huh7增殖,并促进其凋亡;小鼠体内异种移植瘤实验也证明该化合物可以显著抑制肿瘤生长。但实验研究发现鸦胆子苦素D具有毒性强、治疗窗窄等缺陷,限制了其进一步的开发应用。研究目的:为了降低鸦胆子苦素D的毒性,本课题对鸦胆子苦素D进行了衍生物的设计、合成,希望通过对其进行结构改造,在增强或保持其抗肝癌活性的基础上,降低其毒副作用,扩大其治疗窗。由于鸦胆子苦素D的抗肝癌作用靶点不清楚,故按照经典药化思路对该化合物进行了结构修饰与抗肝癌活性研究。研究内容:1、首先对鸦胆子苦素D抗肝癌活性的构效关系进行系统研究,希望在此基础上,指导新衍生物的设计。一方面,针对鸦胆子苦素D结构中的官能团进行结构改造,合成得到了衍生物2-1?2-14;另一方面,从天然产物库中筛选出了鸦胆子苦素D的类似物2-15?2-24。然后用CCK-8方法测试以上鸦胆子苦素D的25个结构类似物对肝癌细胞Huh7以及对正常肝细胞L-02的增殖抑制活性,根据活性测试结果总结得到鸦胆子苦素D抑制肝癌细胞增殖活性的构效关系:1)A环:（1）α,β-不饱和羰基结构为抗肝癌活性必需基团,当其被还原或羰基被其它基团取代后,衍生物或类似物对Huh7以及L-02的增殖抑制活性均消失;（2）1位的羟基游离对活性有利,当其成酯后活性降低。2)B环:6位引入乙酰氧基后活性消失。3)C环:（1）14位游离羟基对活性至关重要,该羟基失去后活性降低或消失;（2）20位碳原子上引入羟基后,丧失细胞毒作用选择性。4)D环:（1）不饱和内酯环结构为活性必需基团,该内酯结构开环或者转移,活性均消失;（2）15位β-OH可以成酯修饰,这些衍生物的增殖抑制活性与鸦胆子苦素D基本相当,但是引入乙酰基或羟基,其增殖抑制活性明显降低,且丧失细胞毒选择性。5)E环:呋喃环为活性必须基团,开环或19位引入羟基则增殖抑制活性消失。2、基于初步构效关系结论,鸦胆子苦素D的15位羟基经酯化反应引入烷基侧链与芳基侧链结构,合成了33个鸦胆子苦素D衍生物（3-1?3-33）。在10μm浓度下,测试这些衍生物对Huh7细胞的增殖抑制活性,对抑制率大于50%的衍生物,进一步在不同肝癌细胞株（Huh7,smmc-7721,hepg-2,qgy-7703）上评价其抗肝癌活性,并在正常肝细胞l-02上评价细胞毒性。最终发现烷基侧链衍生物3-7对不同肝癌细胞的细胞毒选择性均优于先导化合物鸦胆子苦素D,进一步的实验证明3-7可以剂量依赖性诱导肝癌细胞的凋亡。3、基于拼合原理,设计并合成了16个具有呋咱型No供体结构的鸦胆子苦素D衍生物（4-13?4-30）,通过在不同肝癌细胞株以及正常肝细胞上进行增殖抑制活性评价,发现衍生物4-21和4-22的对肝癌细胞的增殖抑制活性和鸦胆子苦素D相当,但对l-02的抑制活性却大大降低（ic50均大于100μm）。为了进一步探索上述两个衍生物的抗肝癌机制,本文对衍生物的No释放能力和诱导肝癌细胞凋亡效果进行了评价,结果显示4-21和4-22具有较强的No释放能力,且可以剂量依赖性的诱导肝癌细胞的凋亡。4、根据前药设计原理,鸦胆子苦素D的15-位羟基经酯化反应引入苯甲酰基和肉桂酰基得到衍生物3-20和3-25,并对其进行体外水解稳定性和水解酶归属研究,结果显示这两个衍生物可以选择性在肝脏羧酸酯酶2的作用下水解释放出鸦胆子苦素D,实现了肝靶向功能。体外细胞实验证实3-25对正常肝细胞l-02的毒性低于3-20,故选择衍生物3-25进行后续生物学评价。通过icr小鼠的急性毒性实验进一步比较鸦胆子苦素D和3-25的毒性,LD50值显示前药3-25(LD50=5.9mg/kg/d)的毒性明显低于鸦胆子苦素D(LD50=2.8mg/kg/d)。最后,通过原位肝癌移植模型对3-25和鸦胆子苦素D的抗肝癌活性进行评价,结果显示:在1.5mg/kg剂量时,这两个化合物的药效相当,但是3-25的给药剂量可以提高到3.0mg/kg,且该剂量下其药效要明显优于1.5mg/kg剂量组。此外,he染色和免疫组化检测也进一步证实了衍生物3-25在体内可以剂量依赖性促进肝癌细胞的凋亡,抑制肿瘤生长。结论:综上所述,本论文针对抗肝癌先导化合物鸦胆子苦素D毒性大、治疗窗窄的缺陷,通过初步构效关系研究、拼合原理以及靶向前药等多种衍生物设计策略,对其进行结构修饰和活性评价,最终筛选得到4个衍生物:3-7、3-25、4-21和4-22,它们其对肝癌细胞与正常肝细胞之间的细胞毒选择性要明显优于鸦胆子苦素D,值得对其进一步研究,且有望代替鸦胆子苦素D开发成为新型的抗肝癌药物。本论文的研究结果将为发现新的抗肝癌先导化合物提供重要的参考价值,同时也为其它活性天然产物的药物化学研究提供一定指导和借鉴意义。