第一部分 PARP-1介导的AIF转位参与链霉素导致耳蜗毛细胞损伤的机制研究研究目的:氨基糖苷类药物导致的毛细胞损伤是感音神经性听力损失研究的重要内容。以链霉素为代表的耳毒性药物在临床上仍然有着重要的应用。目前药物性毛细胞损伤的确切机制尚未完全阐明,传统观点认为其是由含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspases)介导的细胞凋亡过程,但是也有观点认为非Caspases依赖的程序性细胞死亡通路也在其中起着重要的作用。本研究希望通过建立耳蜗毛细胞链霉素损伤模型,探讨一种重要的线粒体来源的细胞死亡调控因子——凋亡诱导因子(AIF),在毛细胞死亡过程中的作用并明确其调控机制,完善链霉素相关听力损失的防治理论基础并寻求新的治疗靶点。研究方法:体外原代培养乳大鼠耳蜗基底膜毛细胞和连续培养HEI-OC1细胞,加入硫酸链霉素(以下简称链霉素)建立毛细胞体外损伤模型,加入链霉素和PARP-1抑制剂3-AB建立毛细胞保护模型。通过Myosin Ⅶla免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察毛细胞,确定链霉素处理24h后基底膜毛细胞的数目及形态并选择合适浓度的链霉素进行后续处理;MTT法检测HEI-OC1细胞链霉素处理后的相对存活率以确定后续实验链霉素浓度,检测3-AB(1 mM)对毛细胞损伤的保护作用;免疫荧光染色结合共聚焦显微镜观察毛细胞内AIF核转位和PARP-1的激活情况;利用线粒体分离技术和Western-blot分析AIF在细胞内线粒体和细胞质中的含量改变;qRT-PCR和Western-blot检测HEI-OC1细胞内PARP-1 mRNA和蛋白的表达情况。研究结果:与对照组相比,不同浓度链霉素(1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml)处理24h后基底膜均出现萎缩,Myosin Ⅶa免疫荧光显示毛细胞不同程度的减少、排列紊乱。链霉素浓度越高,毛细胞损伤越严重。相同链霉素处理浓度下,毛细胞损伤从顶回向底回逐渐加重,其中内毛细胞和外毛细胞损伤程度类似。MTT结果显示链霉素导致的HEI-OC1细胞损伤同样随浓度增加而加重。链霉素(2mg/ml)处理耳蜗基底膜后,残留毛细胞细胞核中既有萎缩表现,也有肿胀表现。对照组基底膜毛细胞免疫荧光染色显示AIF仅出现在细胞浆区域,细胞核区域无染色,而链霉素处理后,毛细胞AIF染色增强,并且细胞核区域出现了明显染色。HEI-OC1细胞中,免疫荧光显示链霉素(5mg/ml)处理后AIF散在出现在细胞核中,Western-blot显示链霉素处理后细胞线粒体内AIF表达降低,细胞质内表达量升高。免疫荧光显示对照组基底膜毛细胞和HEI-OC1细胞均未见明显PARP-1染色,链霉素处理后细胞核出现了 PARP-1强染色。qRT-PCR显示链霉素处理后HEI-OC1细胞PARP-1 mRNA表达明显升高,Western-blot显示PARP-1蛋白表达明显升高。加入3-AB后,MTT检测显示链霉素造成的HEI-OC1细胞损伤减轻,而且Western-blot结果也显示链霉素造成的AIF线粒体中蛋白表达降低而细胞质中升高的趋势消失。研究结论:链霉素可以导致耳蜗毛细胞浓度和位置依赖性的损伤;链霉素损伤毛细胞过程中AIF从线粒体转位到细胞核和细胞质;AIF的转位过程受PARP-1调控。第二部分内毛细胞带状突触在联合应用链霉素和速尿导致的大鼠听力损失中的改变研究目的:目前氨基糖苷类抗生素耳毒性的研究多集中在其如何损伤耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞等,还没有文章探讨听觉传导通路中第一个信号传递点——带状突触,在急性药物性耳聋中的改变。耳蜗中带状突触是一种特化的突触连接,位于毛细胞和螺旋神经节细胞之间,对声音信号快速、持续而准确的传递有着重要的作用。目前研究认为,带状突触可能是听觉通路中最脆弱的部分。我们希望通过速尿和链霉素联合应用构建大鼠急性听力损失模型,探讨药物作用下内毛细胞带状突触的改变。研究方法:大鼠同时分别腹腔注射速尿(200m/kg)和肌肉注射硫酸链霉素(200mg/kg)以构建大鼠急性听力损失模型。听性脑干反应(ABR)检测大鼠各频率的听阈;CtBP2、GluR2&3、Myosin Ⅶa以及Tuj-1免疫荧光染色分别标记突触前部分、突触后部分、毛细胞和螺旋神经节细胞并进行相应的统计分析。研究结果:ABR显示大鼠同时注射速尿和链霉素后1 d即出现全频的听力损失,且1月后仍不能恢复。与对照组相比,药物处理后大鼠基底膜毛细胞CtBP2染色显示带状突触数目明显减少,呈自顶回向底回逐渐加重的趋势,且其损失程度比内毛细胞减少程度更严重。药物处理后残留的部分突触出现肿胀、位置移动等异常表现,且与数目减少程度呈正相关。CtBP2和Glu R2&3标记的突触前后部分在药物处理10 d后明显分离。药物处理10 d后螺旋神经节细胞无明显改变,但是1月后其胞体和神经纤维明显减少,且以顶回和中回为甚。研究结论:速尿和链霉素联合应用可以引起大鼠不可逆的全频听力损失;速尿和链霉素引起的早期听力损失可能由带状突触损伤引起。