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成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factors,FGFs)在多种哺乳动物的卵泡发育过程中发挥着重要的功能。FGFs通过受体酪氨酸激酶(RTK)调控细胞内相关通路,影响细胞的增殖和分化。FGFs的研究集中在颗粒细胞上,而对于调控卵泡膜细胞信号通路及激素合成和细胞凋亡的分子机制等方面的研究尚未见报道。本研究以牛卵泡膜细胞及颗粒细胞为研究对象,采用实时定量PCR、放射免疫分析法和酶联免疫分析法及腺病毒载体感染、Western Blot等技术,探究FGF8和FGF18对两种细胞的激素合成、凋亡等生物相关过程的分子调控机理,以及转录因子早期生长应答因子1(Early growth response protein 1,EGR1)在FGF应答中发挥的作用,以期阐明FGF8和FGF18对卵泡膜细胞、颗粒细胞的调控作用机制。主要获得以下研究结果:1.FGF8和FGF18对卵泡膜细胞的影响经过4天处理,通过流式细胞仪检测发现10 ng/mL的FGF8显著下调卵泡膜细胞的凋亡水平。应用放射免疫分析法分析培养液中的孕酮浓度发现,1 ng/mL的FGF8抑制孕酮的分泌。采用酶联免疫分析法分析培养液中睾酮含量,发现10 ng/mL的FGF8显著下调了睾酮浓度。通过Real-time PCR分析发现,10 ng/mL的FGF8上调Spry1、Spry2和Spry4的mRNA表达水平,而对Spry3基因没有影响。FGF8显著上调NR4A1、NR4A3的mRNA水平,但是NR4A2的表达水平没有变化;FGF8上调ETS转录因子家族的ETV1、ETV4和ETV5的表达水平;FGF8上调EGR1和EGR3的表达水平。Western Blot分析发现FGF8处理后15 min内激活MAPK3/1通路和AKT通路。试验表明,1 ng/mL的FGF18显著抑制卵泡膜细胞的凋亡水平,抑制孕酮和睾酮的分泌。通过Real-time PCR分析发现,10 ng/mL的FGF18对Spry1、Spry2和Spry3的mRNA表达水平没有影响,而Spry4基因表达水平有所上调但是没有显著差异。FGF18对转录因子的调控不同于FGF8:NR4A1、NR4A2在处理后8 h内表达水平没有变化,而NR4A3的mRNA水平显著上升;FGF18处理8 h内只上调ETV4的表达;FGF18同时上调EGR1和EGR3的表达水平。FGF18处理后激活MAPK3/1通路,但是不能激活AKT通路。2.EGR1对卵泡膜细胞的调控作用通过腺病毒载体Ad-EGR1在卵泡膜细胞中过表达EGR1研究其对膜细胞的影响,发现使用MOI=200的病毒感染膜细胞,成功的提高了EGR1蛋白表达量。过表达EGR1不影响MAPK3/1通路和AKT通路。实时定量PCR检测发现过表达EGR1上调了Spry1的m RNA水平,但是不影响Spry2-4的表达;EGR1同时上调NR4A1-3和ETV1、ETV4及ETV5的mRNA水平;EGR1也增加同家族成员EGR3的表达量。过表达EGR1通过下调CYP11和CYP17的表达水平,显著抑制了卵泡膜细胞的激素分泌能力。EGR1抑制了卵泡膜细胞的凋亡,提高了膜细胞的活性。通过siRNA成功干扰了EGR1基因的表达,通过与对照组相比,低水平的EGR1抑制了EGR3、NR4A3和Spry2的表达水平,而ETV1的表达水平没有变化。激素浓度测定发现孕酮和睾酮的分泌量没有变化,但是CYP11和CYP17的表达量上调了一倍。EGR1干扰后促进了膜细胞的凋亡,细胞活性下降。对EGR1沉默后的细胞进行FGF8处理发现其抑制了FGF8对Spry2、NR4A3、ETV1和EGR3的调控作用。3.EGR1对颗粒细胞的调控作用研究表明,FGF8和FGF18抑制颗粒细胞雌激素的分泌,FGF8提高颗粒细胞的活性,而FGF18抑制细胞活性。FGF18对很多FGF应答基因没有调控作用,但是FGF8和FGF18都上调EGR1的表达,说明EGR1可能是FGF18发挥促凋亡作用的关键因子。通过腺病毒载体Ad-EGR1感染颗粒细胞,成功的提高了EGR1蛋白表达量。过表达EGR1上调Spry1、Spry2和Spry4的表达水平,而不影响Spry3的表达。EGR1显著上调NR4A1-3、EGR3、FOS等基因的m RNA水平。EGR1通过上调EREG激活MAPK3/1通路,而对AKT通路没用影响。表达EGR1并不影响颗粒细胞的凋亡,其同时上调促凋亡基因P53等和抗凋亡基因XIAP等。EGR1抑制颗粒细胞雌激素的分泌但是不影响孕酮的合成。综上所述,FGF8和FGF18可以通过和膜受体激酶结合,激活MAPK3/1或AKT信号通路并调控卵泡膜细胞内转录因子EGR1的表达,进而调控相关基因的表达,抑制激素分泌和调控细胞凋亡。颗粒细胞中的EGR1在FGF应答中发挥重要作用,但是FGF18的促凋亡作用不是由EGR1介导。本研究的研究结果为阐明FGFs调控牛卵泡膜细胞、颗粒细胞,及其在卵泡发育中的调控作用提供了理论依据。