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在骆驼科(Camelid)动物的血清中存在一种天然缺失轻链的单域重链抗体(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody,VHH)。VHH仅由重链抗体可变区(Variable region)组成的基因工程抗体,由于分子量小,也称为也称为纳米抗体。与普通抗体及重组单链抗体(single chain fragment variable,scFv)相比,VHH具有分子小、水溶性高、稳定性强、易于表达等优点,因此具有广阔的应用前景。甲胎蛋白分子量69 KDa,成人血浆中含量低于30 ng/m L。当肝细胞发生癌变时,AFP在血清中的含量会明显升高,甲胎蛋白就成了诊断原发性肝癌的一个特异性临床指标,临床检测阈值为400 ng/mL。本研究运用纳米抗体,建立了基于双纳米抗体的夹心免疫PCR检测AFP,该方法灵敏度高、线性范围广。主要研究内容如下:1、AFP羊驼免疫库的构建。AFP免疫羊驼,采取四免血液,分离白细胞,提取RNA。以RNA为模板,反转录构建cDNA文库。通过巢式PCR,扩增目的VHH基因。利用限制性内切酶EcolⅠ和SfiⅠ进行酶切,酶切产物转入到pHENⅠ载体中,电转到E.coli TG1中。构建的免疫库库容量为1.8×108。2、免疫库的生物淘选。采用逐轮减少AFP包被浓度,交换使用封阻液BSA和OVA,从免疫库中获得抗AFP纳米抗体。经过三轮淘选后,随机挑取95个克隆,Indirect ELISA和Sandwich ELISA确定与AFP McAb配对的阳性克隆P-A-18、P-A-65、P-A-80、P-A-83。基于噬菌体展示VHH建立了双抗夹心ELISA,最低检测线0.45 ng/mL,线性范围为1-100 ng/mL。3、阳性克隆的原核表达。提取P-A-18、P-A-65、P-A-80和P-A-83阳性克隆的质粒,经过限制性内切酶NotⅠ和NocⅠ酶切后连接到pET25b(+)载体上,钙转化转入到E.coli Rostta进行IPTG诱导表达。最佳表达温度为30℃,时间11 h,IPTG浓度为0.05 mM。镍柱纯化表达产物N-A-18和N-A-65,建立与AFP McAb配对的Sandwich ELISA。最低检测线为0.65 ng/m L,线性范围为1-100 ng/m L。4、基于双纳米抗体建立RT-PCR。淘选出抗AFP纳米抗体的噬菌体阳性克隆P-A-5并以此为检测抗体,与N-A-18作为包被抗体进行配对,用免疫PCR技术,建立了高灵敏度AFP检测方法。最低检测线为5 pg/mL,线性范围为0.01-10000 ng/m L,线性相关系数为0.9855。研究结果对实现肿瘤标记物的高通量检测提供理论基础。