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本文第一章首先阐述了常用的细胞成像技术及分析技术,其次对实验中所涉及到的肾上腺素受体,特别对受体配体复合物在细胞中的内在化过程进行详细介绍。再次对实验中所用到的荧光染料-量子点的结构、表面修饰、生物共轭以及在药物分析中的应用进行了详细的介绍。最后对实验中所用到的单粒子示踪技术进行了综述。
本文第二章中利用一种由量子点结合受体激动剂去氧肾上腺素的PEG衍生物组成的新型荧光探针实现活细胞中肾上腺素受体的定位与示踪。该探针可以高选择性的与人胚胎肾293α1B细胞上表达的α1B肾上腺素受体结合。最佳的实验条件为探针浓度45nmol/L、孵育时间15min、孵育温度37℃。其次,37℃下受体介导内吞而低温条件(15℃)下受体内吞抑制的实验结果证明了去氧肾上腺素的生物活性不受量子点介入的影响。最后,比较相同条件下该探针与哌唑嗪(肾上腺素受体拮抗剂)探针在同一个细胞中的分布情况,证明该方法可以实时区分激动剂与拮抗剂。实验结果证明该探针具有用于示踪细胞内受体作用动态过程的潜力。
本文第三章中利用上述荧光探针在单粒子水平上示踪活细胞内药物去氧肾上腺素的内吞过程,以揭示药物与受体之间的相互作用,为药物作用机制的研究提供详细信息。我们通过示踪同一个细胞中荧光点的迁移实现了对去氧肾上腺素内吞过程的示踪。首先通过记录连续拍摄荧光图像中荧光点的坐标变化,确定量子点复合物在细胞内运动类型,并通过大量实验数据确定其运动参数,依据其运动参数将整个运动过程划分为6个阶段。其次通过将该探针与不同细胞器染色的荧光图像共定位的方式确定复合物在不同细胞器中的运动参数,并将探针在细胞器中的运动参数与6个阶段的运动参数进行对比,确定其在细胞内完整的内吞过程。实验结果证明该探针成功的示踪了细胞内去氧肾上腺素的动态内吞过程,首次实现了激动剂药物内吞过程的可视化示踪,为药物与受体相互作用的分子机制和动力学性质的研究提供新方法。
本文第四章中建立了一种荧光药物筛选方法用于活细胞中肾上腺素受体拮抗剂的筛选。由量子点结合肾上腺素受体拮抗剂哌唑嗪的PEG衍生物构成荧光探针。前期实验结果证实该探针可以高选择性的与人胚胎肾293α1B细胞上表达的α1B肾上腺素受体结合。加入待筛选药物后,由于发生竞争性抑制,细胞膜表面的荧光发生变化,从而指示药物与受体的亲和活性大小。我们采用全内反射荧光显微术与流式细胞术分别用于定性与定量研究五种已知待筛选药物的亲和活性大小。结果显示其亲和活性顺序为拉贝洛尔>阿呋唑嗪>酚妥拉明>多沙唑嗪>坦洛新。我们进一步计算了其受体亲和系数Ki,计算值与文献值一致。实验结果证实本方法可用于活细胞中α1B肾上腺素受体拮抗剂药物的筛选。
本文第五章中建立了一种基于量子点和切刻内切酶的信号放大方法用于汞离子的选择性灵敏定量检测,并作出了初步的探讨。对实验条件进行了优化,确定了最佳实验条件为:QDs:1.0×10-8molL-1,探针A:1.4×10-7molL-1,探针B:5.0×10-8molL-1,Nt.AlWI:0.15UμL-1。我们进一步研究了QDs的荧光强度与汞离子浓度之间的关系,发现在1.0×10-9mol/L-1.5×10-8mol/L范围内线性良好,线性方程为Y=453.7+2.5×1010C,r=0.9977。该方法有望用于单细胞中汞离子的特异性检测。