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研究背景和目的:Hsp90具有促进新合成的蛋白和变异蛋白折叠的功能,该功能受Hsp90与辅伴侣相互作用和Hsp90与ATP结合/水解所调节。Hsp90作为分子伴侣,其已确定的客户蛋白超过100个。Hsp90能成为抗肿瘤药物的很有前景的靶点,是因为它的许多客户蛋白是细胞增殖信号通路中的重要分子,与肿瘤密切相关。Hsp90的N-端和C-端都能与辅伴侣或ATP相互作用,从而调节其伴侣的活性。近来研究表明Hsp90抑制剂有多类,如作用于Hsp90N-端ATP结合区域的GA和其衍生物17-AAG;作用于Hsp90C-端二聚化区域的顺铂和新生霉素（NB）;影响Hsp90翻译后修饰的组蛋白去乙酰化酶和蛋白酶体抑制剂。新生霉素是香豆霉素类抗生素中的一种,具有抑制DNA回旋酶的功能。作为抗生素已有较深入的研究,其药代动力学和毒理学特征已较清楚。近来研究表明NB是作用于C-端的ATP结合点后促使Hsp90-依赖的客户蛋白降解,该位点是新发现的。Bcr-Abl蛋白是由bcr/abl融合基因编码的,具有比正常的p145c-abl激酶更强的酪氨酸激酶活性,是慢性粒细胞白血病（CML）对抗化疗药物诱导凋亡的主要因素。由于Bcr-Abl是Hsp90的客户蛋白之一,因此抑制Hsp90的分子伴侣功能就很有可能同时阻断Bcr-Abl激活的多条信号传导通路。为了研究NB对表达Bcr-Abl的慢粒细胞的作用,并探讨该作用是否与Hsp90分子伴侣的功能有关,我们研究了NB抑制慢粒增殖和诱导凋亡的作用,并进一步研究Bcr-Abl蛋白水平以及Hsp90和Bcr-Abl之间的相互作用。既然Hsp90C-端和N-端抑制剂都能调节其伴侣活性,我们进一步探究Hsp90C-端抑制剂NB和N-端抑制剂GA的联合及序贯作用效应。如果NB能通过影响Hsp90分子伴侣功能而抑制慢粒细胞增殖,那么它就有可能对STI571耐药、Bcr-Abl阳性的细胞有效。因为STI571耐药主要与Bcr-Abl过量表达和突变有关,为了证实该设想,我们研究了NB对STI571耐药的K562细胞的作用。还研究了NB是否通过诱导分化作用抑制细胞增殖。研究方法:细胞用NB和/或GA处理后,采用AO/EB染色后荧光显微镜观察凋亡形态,采用AnnexinV-FITC/PI双染后流式细胞仪检测细胞凋亡率。为了探讨NB诱导的凋亡与Bcr-Abl的关系,用蛋白免疫印迹法检测Bcr-Abl的含量。为了阐明Bcr-Abl蛋白下降的机制,采用免疫共沉淀的方法研究Hsp90分子伴侣的功能。先将Bcr-Abl与其分子伴侣共沉淀下来,然后用免疫印迹法检测沉淀物中与Bcr-Abl结合的Hsp90、Hsp70、P23和P60Hop含量变化。应用蛋白酶体抑制剂ALLnL研究Bcr-Abl降解的途径。同时也检测CML细胞中其它客户蛋白的含量变化。应用实时定量PCR法检测NB对bcr/abl基因转录水平的影响。用MTT法检测NB对STI-571耐药细胞K562/G01的作用,并测定Bcr-Abl和磷酸化酪氨酸水平。用NBT还原法检测NB诱导白血病细胞分化作用。研究结果:1NB能显著抑制Bcr-Abl+的白血病细胞增殖。HL-60/Bcr-Abl是异位表达p185Bcr-Abl酪氨酸激酶的细胞,其被NB抑制的IC50是0.5174mM;K562是内源性表达Bcr-Abl酪氨酸激酶的细胞,其被NB抑制的IC50是0.4353mM。作为对照细胞,HL-60的IC50是0.3546mM。2 NB促进细胞色素C释放入胞浆,激活caspase-3/9的活性,触发HL-60、HL-60/Bcr-Abl和K562细胞凋亡。3当NB浓度很低时,具有诱导NB4、HL-60和K562细胞分化的作用。NBT还原试验表明NB抑制增殖与其诱导分化有关。4 NB和GA均能降低K562和HL-60/Bcr-Abl细胞中Bcr-Abl的蛋白水平,也能抑制AKT和ERK激酶活性。GA可增加Hsp27和Hsp70的表达,与之不同的是,NB对这两种蛋白无影响,但能减少p60HOP的表达。5虽然NB与Hsp90结合位点与GA不同,但它同GA一样能干扰HL-60、K562和HL-60/Bcr-Abl细胞中Hsp90的伴侣功能。与Raf-1,v-Src和Her-2-neu相似,Bcr-Abl酪氨酸激酶与Hsp90形成伴侣复合物。NB通过与Hsp90结合并抑制其功能,使Bcr-Abl与Hsp90和Hsp70的结合减少,相比之下,GA使Bcr-Abl与Hsp90结合减少但与Hsp70结合增加。因此,NB即有与GA一样的生物效应,也有与它不同的方式影响Hsp90的功能。蛋白酶体抑制剂ALLnL能进一步加强NB引起NP40-insoluble部分Bcr-Abl含量的提高,提示NB通过抑制Hsp90的伴侣功能促进蛋白酶体降解Bcr-Abl蛋白。6联合应用GA和NB有协同作用;NB→GA序贯作用能增强GA抗白血病细胞的能力;GA→NB序贯作用对NB的抗白血病细胞能力无影响。7对STI571耐药细胞株K562/G01敏感,其IC50是0.3490mM,NB可减少K562/G01细胞的Bcr-Abl蛋白含量。结论:本研究首次证明干扰Hsp90伴侣功能,减少Bcr-Abl与Hsp90和辅伴侣的结合是NB抑制CML的重要机制。