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超低温保存是目前植物种质资源安全、有效、长期保存的重要技术之一。但是有些生物材料液氮冻后的存活率和再生率低是限制该技术大规模推广应用的瓶颈问题。目前在动物以及人体组织和细胞的超低温保存中发现,细胞程序性死亡（PCD）是导致一些材料冻存后存活率下降的原因之一,但是植物超低温保存中PCD的研究相对较少。从PCD信号分子及其作用的角度探索植物超低温保存损伤机制,不仅有助于拓展降低植物液氮冻存后死亡率的新方法,也可以丰富低温生物学理论。本研究以芍药‘粉玉奴’花粉为材料,研究活性氧（ROS）、钙离子(Ca2+)、一氧化氮（NO）信号分子在花粉超低温保存PCD发生中的作用及其相互关系,探讨PCD信号分子及其作用机制。主要研究结果如下:（1）花粉超低温保存中发生的PCD直接影响花粉生活力,且为基因所调控。抑制PCD发生,花粉萌发率最高可提高到30.06%（对照组为16.42%）。芍药‘粉玉奴’花粉超低温保存后伴随萌发率降低,指证PCD发生的线粒体膜电位降低、caspase-3-like和caspase-9-like蛋白酶活化、早期凋亡率显著降低、而晚期凋亡率和总凋亡水平显著上升;相关分析显示,这些指标均与花粉生活力显著相关。添加外源PCD调控剂明显影响花粉生活力:线粒体膜电位通透性转换孔抑制剂环孢素A处理较对照萌发率提高了83.06%;caspase-3-like蛋白酶特异抑制剂和caspase-like蛋白酶广谱抑制剂较对照萌发率分别提高了60.69%和76.72%;线粒体膜电位丧失剂以及caspase-like蛋白酶活化剂则显著降低了花粉萌发率,分别较对照降低了30.75%、38.56%。促PCD基因SBT3、RTNLB2、AMC9、BAG6、PDCD4、PDCD2、ATG8CL、ACD11表达量上调,抑PCD基因DADI、BI-1、LSD1表达量下调。（2）液氮冻存后花粉ROS含量显著增加,较对照提高了47.38%,且与PCD显著相关,其中H2O2与PCD和生活力均高度相关。添加适宜浓度的ROS清除剂（CAT、As A、GSH）内源ROS含量下降,为对照的29.97%、33.97%、32.15%,花粉萌发率提高了30.80%、50.06%、33.52%;分别降低了5.47%、26.61%、11.87%的caspase-3-like蛋白酶活性以及10.44%、25.54%、14.32%的caspase-9-like蛋白酶活性;分别降低了22.08%、26.82%、19.00%晚期凋亡率以及16.08%、20.96%、18.29%总细胞凋亡率。同时促PCD基因PDCD4、BAG6、RTNLB2的表达量下调。表明信号分子ROS参与了花粉超低温保存中PCD发生。（3）超低温保存后花粉胞内Ca2+含量显著增加,较新鲜花粉提高了84.94%,相关性分析显示Ca2+含量与PCD和花粉萌发率均显著相关。液氮冻存后添加Ca2+载体A23187,伴随着内源Ca2+含量的升高,caspase-3-like和caspase-9-like蛋白酶活性分别提高了7.78%和9.05%;线粒体膜电位水平降低了63.25%、晚期细胞凋亡率和总凋亡率分别提高了56.52%和52.94%;促PCD基因PDCD2、PDCD4、SBT3表达量显著上调、抑PCD基因BI-1表达量显著下调。而添加Ca2+螯合剂EGTA则发挥了与之相反的作用,在降低6.43%内源Ca2+含量的同时;caspase-3-like和caspase-9-like蛋白酶活性分别降低了22.77%、27.41%;晚期细胞凋亡率和总凋亡率分别下降了25.00%、23.53%;3个促PCD基因显著下调表达、抑PCD基因BI-1显著上调表达。表明信号分子Ca2+参与了花粉超低温保存中PCD的发生。（4）超低温保存后花粉NO含量显著增加,相关分析显示与PCD高度相关。添加适宜浓度的NO载体SNP,花粉萌发率降低了16.81%;caspase-3-like蛋白酶和caspase-9-like蛋白酶活性分别提高12.20%和4.9%;线粒体膜电位水平下降53.88%;晚期细胞凋亡率和总凋亡率分别升高17.65%和15.79%;促PCD基因PDCD2和ATG8CL的表达量显著上调、抑PCD基因DAD1、BI-1、LSD1表达量显著下调。而添加NO清除剂c-PTIO作用相反,液氮冻存后花粉萌发率提高了55.36%,内源NO含量降低了32.92%;caspase-3-like蛋白酶和caspase-9-like蛋白酶活性分别下降12.92%和20.99%;晚期细胞凋亡率和总凋亡率分别下降25.53%和21.05%;3个促PCD基因表达量显著上调、3个抑PCD基因表达量显著下调。表明信号分子NO参与了花粉PCD的发生。（5）花粉超低温保存中ROS、Ca2+、NO三者之间存在着双向影响关系。调控ROS含量,Ca2+和NO含量及其产生相关调控指标均发生了显著变化;调控Ca2+含量,ROS和NO含量及其产生相关指标发生了显著变化;调控NO,ROS和Ca2+含量及其相关指标发生了显著变化。其中,IP3所调控的钙离子通道以及Ca2+-ATPases可能是ROS和NO调控内源Ca2+浓度的作用途径之一;而Ca2+和NO对ROS的调控可能是通过活化NADPH氧化酶、抑制酶类及非酶类抗氧化物质含量,特别是As A-GSH抗氧化循环系统;参与NO生物合成的NOS-like酶可能是ROS和Ca2+调控胞内NO含量的作用途径之一。（6）花粉超低温保存中添加Ca2+抑制剂对参与启动PCD的caspase-9-like蛋白酶有明显的抑制效果;而ROS抑制剂对稍后参与执行PCD的caspase-3-like蛋白酶、晚期凋亡率和促PCD相关基因产生了明显抑制作用;采用两步法,先添加Ca2+抑制剂后添加ROS或NO抑制剂对这两个caspase-like蛋白酶抑制效果均高于单独添加抑制剂或者其他分次序添加处理,表明花粉超低温保存PCD发生过程中,Ca2+位于ROS和NO的上游发生作用,与PCD启动密切相关;而ROS通过影响caspase-3-like蛋白酶和PCD相关基因表达,在PCD执行阶段发挥着重要的作用;而NO则是通过影响ROS和Ca2+含量,在PCD发生中起辅助作用。存在PCD信号调控网路,值得进一步研究。本研究基于细胞形态特征、生化水平、分子水平确定了花粉超低温保存中PCD的发生;信号分子ROS、Ca2+、NO与芍药花粉超低温保存PCD发生密切相关;并且Ca2+在PCD启动、ROS在PCD执行中作用更大,NO主要起辅助作用,同时三者之间存在着双向互作的关系。