作为国际范围内最高发病率的慢性肝脏疾病,非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)在当前世界发病率约为25%-45%,是引起肝癌的主要因素和导致肝脏移植手术的首要诱因[1,2]。NAFLD是一种排除滥用酒精和其他确定因素而导致肝脏损伤的代谢性疾病,是以肝细胞内弥漫性脂质囤积为基本特点的临床综合征,囊括单纯性脂肪肝(Simple fatty liver,SFL)、非酒精性脂肪肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis,NASH),甚至是相关性肝硬化(liver fibrosis)等一系列病变[3]。NAFLD治疗当前以合适的体能锻炼、减轻患者体重和改善饮食营养结构为主,目前尚无针对其发病机制的药物用于治疗[3,4]。针对NAFLD的研究很多,但是其发病机制尚未完全明确。铁(Iron)是人体内含量最高的微量金属,参与血液循环氧气运输、DNA合成和能量代谢等重要生理活动[5]。机体缺铁是当今最常见的疾病之一,可以引发真菌感染和贫血[6,7]。但是同时铁也是机体最重要的脂质过氧化促进剂。过氧化氢与二价铁离子的混合后会产生OH·自由基,该过程称为芬顿反应。OH·自由基的氧化电势可达2.73 V。OH·自由基氧化能力十分突出,在自然界中其氧化能力仅此于氟气,可将包括羧酸、醇、酯类在内的很多已知的有机化合物氧化为无机态。芬顿反应发生后,可产生高反应性强破坏性的ROS损伤细胞和器官[8]。因此,无论是缺铁还是铁超载均会对机体产生损伤。铁死亡(Ferroptosis)是一种近些年发现的铁依赖细胞程序性死亡方式,以铁超载和脂质过氧化反应为主要特征,在形态学上主要表现为质膜起泡、线粒体变小和线粒体嵴减少甚至消失,双层膜结构密度升高,胞内ROS生成增多[9]。铁死亡发生机制与胞内谷胱甘肽(Glutathione,GSH)水平降低与谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase,GPX4)活性失效关联密切,因为降低细胞内GSH水平可削弱GPX4对ROS细胞毒性作用的防御能力[10]。肝脏组织是铁储存和脂质代谢的主要场所,因而肝脏同时具备以上两种物质代谢通路。而NAFLD是同时兼有肝脏损伤和脂质囤积过度的慢性代谢性肝脏疾患,因而铁超载与NAFLD之间密切关联。有研究发现在NAFLD等多种慢性肝病中存在轻到中度的肝脏铁负荷[11],而利用膳食限制小鼠铁摄入造成肝脏组织低铁,可以减轻小鼠肝脏NAFLD的炎症和纤维化[12]。因此,本课题尝试利用去铁酮(deferiprone,DFP),一种铁螯合剂,降低肝脏的铁负荷,并从炎症、纤维化和氧化应激和铁死亡的角度检验其是否能够缓解NAFLD,并对其潜在的机制进行探讨。实验方法:1.设定3组实验动物,每组数量不少于6只,分别为Chow组,HFD组和HFD+DFP组。我们用普通动物饲料喂养Chow组16周,用高脂食疗喂养HFD组和HFD+DFP组16周。而在HFD组和HFD+DFP组喂食高脂饲料的第14周开始,分别灌喂生理盐水和去铁酮共计2周,设定去铁酮给药量为80mg/kg/d。造模完毕后,解剖各实验组小鼠,取得血清与肝脏组织作为样本。2.评估去铁酮对NAFLD实验动物模型中肝脏组织形态学的作用,并以此为依据作出NAS评分。通过比较HFD组小鼠与HFD+DFP组之间肝细胞气球样变、脂滴空泡、炎症细胞浸润的程度与NAS评分总分差异,可以判断去铁酮能否减轻NAFLD中的肝脏损伤,改善肝脏形态学异常,减少罹患NASH的可能。3.探索去铁酮在NAFLD小鼠肝组织炎症反应中作用。我们检测包含TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1及CD68在内的炎症反应标志物在三组小鼠肝脏中的变化,通过比较HFD组与Chow组小鼠肝脏以上指标的差异,判断去铁酮能否抑制NAFLD中的炎症激活。4.判断去铁酮在NAFLD小鼠肝脏纤维化过程中发挥的作用。通过对各组小鼠肝脏组织使用石蜡切片进行Masson染色、天狼星红染色和α-SMA免疫组织化学染色,并且通过显微镜观察对比HFD组与HFD+DFP组小鼠肝脏纤维化程度的差异,得出去铁酮能否具有减轻NAFLD小鼠肝脏纤维化程度的作用。5.去铁酮对NAFLD实验动物模型中肝脏的氧化应激的影响作用。通过对比Chow和HFD组实验动物肝脏组织中的过氧化氢、MDA和ROS水平,可以观察到NAFLD病程中氧化应激升高。通过对比HFD和HFD+DFP组实验动物的以上指标,明确去铁酮对于HFD诱导的NAFLD模型的肝脏组织氧化应激水平的影响。6.研究去铁酮对于肝脏组织铁含量的作用。通过检测转铁蛋白(Transferrin)和铁蛋白(Ferritin)及肝脏总铁含量在各实验组中的含量。通过比较HFD组和Chow组之间指标的差异,阐明在NAFLD发病过程中是否存在铁超载;通过比较HFD组与HFD+DFP组之间的指标差异,判断出去铁酮是否可以缓解NAFLD病程中肝脏组织的铁超载。7.探讨铁死亡是否参与NAFLD发病机制,并且判断去铁酮对NAFLD小鼠肝脏细胞铁死亡的作用。我们通过检测铁死亡的重要标志分子,包括ACSL4、ALOX15和GPX4在肝脏中的表达水平,并且通过对比以上指标在各组实验动物的差异,判断NAFLD的发病与铁死亡之间的关系,并且验证去铁酮是否能抑制NAFLD小鼠肝脏细胞铁死亡发生。实验结果:1.相对Chow组小鼠,HFD组小鼠表现出更高的铁蛋白、转铁蛋白和肝铁含量水平。再通过对比HFD组与HFD+DFP组上述指标,可发现在去铁酮干预下,小鼠肝脏的铁超载有所减轻。2.相对于Chow组,HFD组小鼠在肝脏组织HE染色中表现出明显的肝细胞气球样变、炎症细胞浸润与脂滴泡形成,NASH评分总分明显升高。而比较HFD组与HFD+DFP组可以发现,肝脏细胞气球样变、脂滴空泡和炎症细胞浸润等情况明显有所改善,NAS评分总分明显下降。3.相对于HFD组小鼠,HFD+DFP组小鼠在炎症因子指标上有所降低,表现出更低水平的TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1及CD68。4.相比于HFD组,经过去铁酮干预的小鼠在肝脏切片Masson染色、天狼星红染色以及α-SMA免疫组化染色中显现出更轻的肝脏纤维化程度。5.相对于Chow组,HFD组小鼠肝脏组织过氧化氢、MDA和ROS均明显加增加。而通过对比HFD组与HFD+DFP组发现,经过去铁酮干预,小鼠肝脏组织内以上各项反映氧化应激指标均明显有所改善。6.相对于Chow组,HFD组小鼠肝脏中显示ACSL4与ALOX15上调与GPX4下调。而对比HFD组,HFD+DFP组小鼠表达的ACSL4与ALOX15明显下降而GPX4水平则有所上升。实验结论1.去铁酮改善NAFLD病程中组织形态学、炎症反应、纤维化和氧化应激。2.去铁酮可以减轻肝铁负荷和抑制铁死亡,从而改善NAFLD。