牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）是我国特有的植物种质资源,素有“花中之王”的美誉,兼具观赏、药用和油用价值。然而,常规牡丹品种一年一次开花且花期较短的特性使得牡丹的全年有效观赏期较短,制约了牡丹的商品化应用,因此,培育花期改良的牡丹新品种已成为亟待解决的问题。牡丹品种‘海黄’具有一年二次开花的特性,对研究牡丹二次开花的分子调控机理具有重要意义,为此,本研究以一年一次开花的品种‘凤丹’和一年二次开花的品种‘海黄’为材料,利用解剖学方法观察‘凤丹’和‘海黄’花芽的发育特征,并通过全长转录组测序和二代转录组测序分析,解析‘海黄’二次开花的分子调控机理,并鉴定到在‘海黄’开花时间调控中发挥重要功能的MADS-box家族基因,验证了其功能。主要结果如下:（1）对‘凤丹’和‘海黄’的花芽不同发育阶段进行解剖观察,发现‘凤丹’和‘海黄’第一次花芽发育阶段的发育特征相似。在营养期S1,顶端分生组织略尖;进入花芽分化期S2,顶端分生组织变平坦,并在两侧分化出花器官原基细胞;当外界温度降低,花芽进入休眠期S3,此阶段花芽不再生长,而是继续完成花芽的分化;到次年3月,外界气温回升,花芽进入萌发期S4,在此时期内花芽迅速生长膨大,分化形成花器官,随后进入开花期。‘海黄’第二次花芽的发育不经历休眠期,只有两个阶段,营养期S5和花芽分化期S6。其中营养期S5与第一次营养期S1的发育特征一致,呈凸起状,营养期结束后迅速进入花芽分化期S6,在此时期内‘海黄’花芽迅速分化形成花芽原基,完成此次花芽分化之后,不进入休眠期,而是直接进入开花期。（2）对‘海黄’二次开花过程中的六个花芽发育时期进行混样全长转录组测序,共获得平均31.77 Gb的数据,经过序列校正之后,得到81 753条平均长度为2 060 bp的高质量全长转录本序列。这些基因中共有60 964条转录本能够注释功能,共有75 646个转录本能够获得CDS序列预测,获得的CDS序列平均长度为708 bp。‘海黄’花芽的全长转录本经完整性评估后,结果显示完整的基因占85%,是较完整的转录本序列。同样对‘凤丹’开花过程中四个花芽发育时期进行混样全长转录组测序,共获得18.44 Gb的测序数据,经序列校正后,得到85 371条平均长度为3 738 bp的高质量全长转录本序列。这些序列中能被功能注释到的有76 748条,能预测到CDS共83 456条,平均长度为955bp。完整基因占79.9%,是较完整的转录本序列。（3）对‘海黄’二次开花过程中花芽发育的六个典型时期进行二代转录组测序,回帖到对应的全长转录组序列中,获得每个时期基因的表达量。通过比较每两个相邻时期花芽中的表达量,共获得21 400个差异表达基因,休眠期S3和萌发期S4之间的差异基因最多,共10 658个,而第二次花芽营养期S5和分化期S6之间的差异表达基因最少。对相邻时期DEG进行GO富集分析、KEGG通路富集分析和表达趋势分析,结果显示,‘海黄’花芽发育过程中涉及细胞分裂、生物节律、植物激素等途径的基因,其中生长素和细胞分裂素信号途径在花芽分化阶段发挥促进作用,而油菜素内酯则发挥抑制作用,另外,‘海黄’花芽在第二次分化结束后不进入休眠而直接开花的发育特征与ABA信号途径的基因表达量较低相关。在‘海黄’差异基因的分析中鉴定得到614个转录因子,其中有40个是MADS-box家族基因。（4）在‘海黄’和‘凤丹’中分别鉴定到338和280个开花时间调控基因,将其归类于五个开花途径和成花整合子、成花抑制子等基因后分析其表达量,结果显示,光周期途径、自主途径和年龄途径、GA途径都参与了‘凤丹’和‘海黄’中第一次花芽发育的过程中,而春化作用则主要促进花芽中花器官的发育。光周期途径、自主开花途径和GA途径参与促进‘海黄’的第二次花芽发育,而春化途径和年龄途径并无明显的调控作用。（5）鉴定得到50个‘海黄’中的MADS-box家族基因和37个‘凤丹’中的MADS-box家族基因。利用系统进化与结构分析解析了这些成员的进化关系,将其分为Mα、Mβ、Mγ、MIKC*和MIKCC五类。其中,在MIKCC类MADS-box成员中鉴定到FLC、SVP和SOC1等开花时间调控的同源基因,也鉴定到AGL6、AG等花器官发育相关基因的同源基因。利用转录组数据对MADS-box家族基因进行表达特征分析,鉴定到特异调控‘海黄’和‘凤丹’的花芽发育过程中各个时期的基因,为后续基因功能验证提供了有效的支撑数据。（6）对‘海黄’中的PlMADS39和PlMADS48在开花时间的调控机理方面进行了功能研究。结果显示,PlMADS39和PlMADS48均定位于细胞核,并且PlMADS48具有转录激活活性。过表达PlMADS39和过表达PlMADS48的转基因拟南芥均表现出早花的表型。其中,PlMADS48可以结合成花整合子Pl FT的启动子,而PlMADS39则可以与Pl FT发生蛋白之间的互作。因此推断,PlMADS48是通过结合Pl FT的启动子调节其表达量来促进开花的,而PlMADS39则可能是通过与Pl FT的互作来调控开花的。综上所述,本论文解析了‘凤丹’和‘海黄’的花芽在开花过程中的发育特征;挖掘了调控‘海黄’二次开花的调控途径;筛选了开花时间调控途径的基因,解析了调控‘凤丹’和‘海黄’开花过程中各个途径发挥的功能;鉴定并筛选出参与调控开花时间的MADS-box家族基因PlMADS39和PlMADS48,验证并推测了其促进开花的功能机理。本研究为进一步阐明牡丹开花以及多次开花的调控机理提供了证据,也为后续牡丹的花期改良定向育种提供了新的候选基因。