钾离子通道(potassium channel)是选择性允许K离子跨膜通过的离子通道,是目前发现的亚型最多、作用最复杂的一类离子通道,广泛分布于骨骼肌、神经、血管、气管、胃肠道、血液及腺体等细胞。钾离子通道在调节细胞的膜电位和兴奋性以及平滑肌的舒缩活动中起重要作用。KCNQ基因编码的外向延迟整流钾离子通道具有六个跨膜结构域和一个孔区,是钾离子通道家族中一个非常重要的亚家族,这个家族的两个成员即KCNQ2/KCNQ3(Kv7.2/Kv7.3)是构成M电流的分子基础,具有慢激活、非失活的电压依赖外向钾离子电流特征。M电流因能被毒蕈碱受体(muscarinic receptor)强烈抑制而得名。M通道在神经系统中分布广泛,除交感神经元外,在皮层、海马、背根神经元等部位也有分布。M电流的抑制将导致神经系统兴奋性升高,而M通道功能失调与良性家族性新生儿惊厥症(BFNs)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer)、癫痫等疾病有关。因此自其发现至今人们做了大量关于M电流调节机制的研究,G蛋白偶联的受体激活后信号通路的下游分子包括PKC、AKAP150、CAM、钙离子、花生四烯酸及代谢产物等均被证实参与了M电流的抑制过程。KCNQ2/Q3离子通道的磷酸化也参与了M电流的调节过程。研究表明,PIP2本身可以激活M电流,而PIP2的水解则是受体介导的电流抑制的原因之一。PIP2,磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸是信号转导通路中的关键节因子,PIP2的代谢对离子通道的功能有重要调节作用。经磷脂酶C(PLC)水解后PIP2生成DAG和IP3,二者可作为第二信使分别激活PKC,促进细胞内钙库释放。水解的同时PIP2的再合成也在不断进行着,从磷脂酰肌醇磷酸(PI)开始,在磷脂酰肌醇磷酸四磷酸激酶(PI4K)催化作用下,肌醇环的四位发生磷酸化生成PIP,进而PIP5K以PIP为底物使肌醇环的五位发生磷酸化最终生成PIP2。PI4K在PIP2的再合成过程中起了重要作用。而PI4K主要分布在高尔基体及粗面内质网,PI4K的激活需要进行转位到PI富集的部分发挥磷酸激酶的活性,此外PI4K的激活和PKC的活性有很大关系。本实验小组在研究表达在爪蟾卵母细胞上KCNQ2/Q3钾电流调节机制过程中发现,细胞膜的持续去极化引起KCNQ2/Q3电流的增大,同时也发现PKC的激活剂佛波酯(PMA)同样在短时间内使KCNQ2/Q3电流增大,本实验就这一实验现象分别以通道磷酸化、PIP2通路等调节途径为研究对象试图寻找细胞膜去极化引起KCNQ2/Q3电流增大的分子机制。目的:研究爪蟾卵母细胞中外源性表达的KCNQ2和KCNQ3通道蛋白在细胞膜去极化条件下通道磷酸化程度的改变与去极化所引起电流增大关系。细胞膜去极化引起KCNQ2/Q3电流的增大与PIP2再合成过程中磷脂酰肌醇四磷酸激酶(PI4K)以及PKC活性的关系。方法:(1)cRNA的体外转录:KCNQ2和KCNQ3通道克隆在质粒载体pGEMHE中,其序列已经测序验证。用适当的限制性内切酶NheI将质粒线性化后,用RibomaxTM Large Scale RNA Production Systems T7 Kit体外转录KCNQ2和KCNQ3通道的cRNA。(2)爪蟾卵母细胞的分离与注射:在爪蟾冰冻麻醉状态下,取出卵母细胞。在含2 mg/ml胶原酶的OR2液中振荡消化1.5~2小时,OR2液的成分为(mM)NaCl 82.5, KCl 2, MgCl2 1, HEPES 5(pH 7.4)。待细胞消化为单细胞后用ND96液清洗细胞,挑选状态良好的爪蟾卵母细胞进行KCNQ2/3通道cRNA注射,注射后的细胞在含2.5 mM丙酮酸钠的ND96中19~20℃培养,ND96溶液构成为(mM):NaCl 96,KCl 1, CaCl2 1.8, MgCl2 1, HEPES 5, pH 7.4。(3)用双电极电压钳(two-microelectrode voltage clamp, TEVC)方法检测KCNQ2/3通道在卵母细胞中的表达情况和电流特性。(4)细胞膜蛋白的提取与免疫共沉淀:将表达通道的卵母细胞分为对照组和去极化处理组(ND96-K孵育15 min)分别用玻璃匀浆器进行匀浆,4℃,5000 g,离心5 min。取上清,用超速离心机4℃,200,000 g,离心1 hr,弃上清,用裂解缓冲液重悬沉淀(1μl/细胞)。将提取好的膜蛋白加入特异性抗酪氨酸磷酸化的抗体或者抗通道抗体,4℃,摇床60转每分钟过夜,次日加入protein G beads,4℃,摇床60转/分钟,2 hr后洗涤珠子,将纯化的酪氨酸磷酸化蛋白或通道蛋白免疫复合物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),电转移至PVDF膜上,脱脂奶粉封闭后,用特异性一抗和HR标记或荧光染料标记的二抗进行检测,显色用DAB或Odyssey9120双色红外激光成像系统仪器扫描。检测通道酪氨酸磷酸化的变化。(5)细胞全蛋白的提取与免疫印迹:将去极化处理以及PMA孵育20 min的卵母细胞用玻璃匀浆器进行匀浆,4℃,12000 g,离心30 min。取上清进行免疫印迹,方法同前。(6)细胞免疫荧光:将去极化处理以及PMA孵育的卵母细胞用甲醛固定后,用PBS配制含3% BSA和0.2% TritonX-100的封闭液进行封闭,加入特异性一抗和荧光标记的二抗,用激光共聚焦扫描显微镜观察标本显色情况。(7)免疫组织化学:将去极化处理以及PMA孵育的卵母细胞用甲醛固定后脱水、包蜡、切片处理后进行脱蜡抗体修复,进行特异性抗体免疫。(8)RT-PCR:提取不同组别卵母细胞的总RNA,并进行凝胶电泳检测,定量800 ng/ul。以RNA为模板反转录cDNA,以PI4K特异性引物扩增片PI4K片断,根据PCR产物的量指示PI4K的mRNA水平的变化。(9)RNA干扰技术:使用RNAi设计软件设计特异性干扰PI4K的siRNA和dsRNA,同时也设计siRNA的阴性对照Sramble small RNA(ssRNA,打乱siRNA碱基排列顺序),并用化学合成的的方法以及PCR技术合成siRNA,ssRNA和dsRNA的DNA模板,T7 RiboMAX? Express RNAi System转录为双链siRNA,ssRNA和dsRNA,注射进卵母细胞降低卵母细胞中PI4K蛋白的表达,观察KCNQ2/Q3电流的变化(。10)PKC-活性分析:检测去极化以及PMA孵育条件下PKC活性的变化。结果:(1)分子生物学实验结果:用限制性核酸内切酶NheI将环状的KCNQ2和KCNQ3通道的质粒DNA线性化,用琼脂糖凝胶(0.8%)电泳分析线性化结果。环形的质粒比线性化完全的质粒DNA电泳条带走的要快,位置在前面,通过该电泳带的电泳位置与DNA质量标准Marker对照可粗略得出该质粒DNA的分子量。体外转录RNA并进行电泳分析,用琼脂糖凝胶(1.0%)电泳方法可得到一条清晰的RNA条带,条带均匀整齐无拖尾现象,经RNA定量,RNA浓度约为350 ng/l。(2)KCNQ2/3通道表达:向卵母细胞注射RNA后的第2~3天,即可用双电极电压钳制(TEVC)方法检测到KCNQ2/Q3电流,免疫印迹结果表明通道蛋白表达良好。(3)免疫共沉淀观察到细胞膜去极化处理(用ND96-K溶液孵育)的通道蛋白磷酸化条带并没有变化,KCNQ2和KCNQ3通道蛋白的磷酸化程度与正常对照之比分别为1.01±0.02(n=6)和0.99±0.03(n=5)。(4)细胞膜去极化的卵母细胞中被检测到PI4K蛋白量明显增加:Western blot的免疫印迹条带明显加深,增加的比例分别为1.48±0.05(n=10),采用免疫荧光,激光共聚焦扫描显微镜进行观察,细胞膜去极化的卵母细胞荧光强度变化明显增强,统计荧光强度增加的比例为2.54±0.52(n=7);细胞免疫组织化学技术显示荧光强度增加的比例为2.54±0.30(n=8)。但是PI4K特异性引物所扩增的RT-PCR的条带并没有明显增加,与正常对照相比1.09±0.09(n=5)。(5)PMA孵育后的卵母细胞中PI4K蛋白量明显增加:Western blot的免疫印迹条带明显加深,增加的比例为1.49±0.12(n=6),而使用PMA无效类似物4α-PMA处理组没有明显变化(1.09±0.06,n=6);采取免疫荧光,激光共聚焦扫描显微镜进行观察,PMA孵育的卵母细胞荧光强度变化明显增强,统计荧光强度增加的比例为1.98±0.23(n=6);细胞免疫组织化学技术显示荧光强度增加的比例为1.98±0.23(n=7)。但是PI4K特异性引物所扩增的RT-PCR的条带并没有明显增加,与正常对照相比1.07±0.16(n=5)。(6)RNA干扰技术将PI4K的表达下调后,外源性表达KCNQ2和KCNQ3通道后,细胞膜去极化15 min后电流增大的比例由正常组的2.12±0.40(n=8)变为0.95±0.24(n=8),PMA对KCNQ2/Q3电流的增强作用由原来的2.86±0.30(n=9)变为1.92±0.23(n=9)。同样在用PKC的抑制剂Bis(Bisindolymalimide)孵育蛙卵以后,细胞膜去极化和PMA孵育对蛙卵的PI4K蛋白表达不再有影响。(7)PKC活性分析结果显示细胞膜去极化和PMA都能使PKC特异性的底物发生了更多的磷酸化,统计各自增加的比例分别达到1.43±0.086(n=7)和1.53±0.15(n=7)。(8)用双电极电压钳记录无钙外液灌流(加入钙离子的络合剂1 mM EDTA)时KCNQ2/Q3电流,试验结果表明去极化依然可以增大KCNQ2/Q3电流,增大2.35±0.12倍(n=7);同样灌流200μM的钙离子通道阻断剂Cd2+也不能去除去极化引起的KCNQ2/Q3电流的增大,增大2.18±0.22倍(n=6);钙耗竭剂(thapsigagin,10μM)和钙离子载体(ionomycin,10μM)都不能抑制去极化引起KCNQ2/Q3电流的增大:增大2.0±0.18倍(n=5),增大2.25±0.25倍(n=7)。结论:(1)细胞膜去极化没有改变KCNQ2/Q3蛋白的磷酸化状态,这与药理学实验结果一致,说明离子通道本身的磷酸化并不是KCNQ2/Q3电流增大的原因。(2)PIP2本身可以直接调节KCNQ2/Q3电流,而本实验结果表明细胞膜去极化可激活参与PIP2合成的磷酸激酶PI4K。(3)由PMA诱发的PKC激活也能增强KCNQ2/Q3电流,同时也使PI4K活性增加。(4)细胞膜去极化可以直接增强PKC活性。(5)PKC抑制剂能够阻断膜去极化诱发的PI4K活性增强。上述结果表明去极化引起KCNQ2/Q3电流增大是由于PKC的活性增加,进而激活PI4K使PIP2的合成增多所致。