【摘 要】
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泰妙菌素（tiamulin,TML）是一种半合成的截短侧耳素类衍生物,对多种革兰氏阳性菌和支原体有抑制作用,被广泛用作兽药和饲料添加剂,主要用于治疗畜禽肺部和胃肠道感染以及促进动物生长。然而,TML一旦过量使用可能会导致其在动物组织中残留,并通过食物链进入人体,从而危害人类健康。因此,为保证食品安全,有必要建立快速、准确的泰妙菌素检测方法。由于免疫学检测方法具有灵敏、简单、快速等众多优势,已被广泛
【基金项目】
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国家重点研究计划课题“环境污染物在食品原料中迁移转化与富集机制”,课题编号:2019YFC1604501；
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泰妙菌素（tiamulin,TML）是一种半合成的截短侧耳素类衍生物,对多种革兰氏阳性菌和支原体有抑制作用,被广泛用作兽药和饲料添加剂,主要用于治疗畜禽肺部和胃肠道感染以及促进动物生长。然而,TML一旦过量使用可能会导致其在动物组织中残留,并通过食物链进入人体,从而危害人类健康。因此,为保证食品安全,有必要建立快速、准确的泰妙菌素检测方法。由于免疫学检测方法具有灵敏、简单、快速等众多优势,已被广泛应用于食品安全检测中,然而目前关于泰妙菌素的免疫学检测方法研究还比较少。本研究首先制备了泰妙菌素单克隆抗体,并通过同源建模和分子对接的方法,初步研究了泰妙菌素单克隆抗体可变区的三维结构以及与泰妙菌素的相互作用;基于此单克隆抗体,分别建立了 ELISA法和电化学免疫传感器以检测泰妙菌素,为构建和完善泰妙菌素残留检测方法提供了一定的理论和技术支撑。本研究的具体内容分述如下:第一部分:泰妙菌素人工抗原的合成与鉴定。本部分采用肟化法和活泼酯法制备了 TML人工抗原TML-BSA（免疫原）和 TML-OVA（包被原）。UV-Vis 和 SDS-PAGE 方法证明 TML-BSA 和 TML-OVA合成成功。免疫学方法证明TML-BSA可诱导Balb/c小鼠产生对TML的免疫反应,多抗血清效价和半数抑制浓度（IC50）分别达到1:12800和5.572ng/mL。第二部分:泰妙菌素单克隆抗体的制备。本部分采用杂交瘤技术筛选泰妙菌素单克隆抗体,共得到6株分泌抗TML的单克隆抗体细胞株,其中2E11单克隆抗体的效价为1:512000;IC50为0.338 ng/mL;亲和常数为6.374×109 L/mol;重链亚型为IgG1型,轻链亚型为Kappa型;除与瑞他帕林有2.7%的交叉反应率外,与其他抗生素的交叉反应率均小于0.01%,说明本研究制备的单克隆抗体具有良好的灵敏性和特异性,可用于建立免疫学检测方法。此外,本研究还首次利用生物信息学方法对TML单克隆抗体可变区及其与泰妙菌素的相互作用进行了研究,结果表明氢键和疏水作用是泰妙菌素单克隆抗体可变区与TML相互结合的主要作用力。第三部分:泰妙菌素酶联免疫吸附法的建立。本部分建立了间接竞争酶联免疫吸附法（indirect competitive enzyme-linked immunosorbentassay,icELISA）用于泰妙菌素的检测,在最优实验条件下建立抑制曲线测得IC50值为0.257ng/mL,线性检测范围为0.0847～0.778ng/mL,添加回收实验测得回收率为90.60%～102.12%,相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）小于8.76%。此外,本研究首次合成了辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase,HRP）标记的泰妙菌素（HRP-TML）,应用此 HRP-TML 建立了直接竞争酶联免疫吸附法（direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay,dcELISA）检测泰妙菌素,在最优实验条件下建立抑制曲线测得dcELISA的IC50值为0.332ng/mL,线性检测范围为0.0897～1.225 ng/mL,添加回收实验的回收率为90.24%～105.73%,RSD小于7.55%。以上结果表明本研究建立的两种ELISA方法检测泰妙菌素均具有较高的准确性。第四部分:泰妙菌素电化学免疫传感器检测方法的建立。本部分研制了两种无标记的电化学免疫传感器,首次用于TML的检测。基于AuNPs/Ag-GO纳米材料的免疫传感器的线性检测范围为0.01～1000 ng/mL,最低检测限（LOD）为0.003 ng/mL（S/N=3）,添加回收实验的回收率为90.70%～109.04%,RSD小于8.18%;基于SPA/Ag-GO纳米材料的免疫传感器的线性检测范围为0.05～100ng/mL,LOD为0.04ng/mL（S/N=3）,添加回收实验的回收率为93.57%～104.70%,RSD小于6.61%。本研究研制的电化学免疫传感器的线性检测范围和最低检测限优于其他报道的TML检测方法。综上所述,本研究制备了灵敏性好和特异性强的泰妙菌素单克隆抗体,并分析了该单克隆抗体与TML相互结合的主要作用力;基于此单克隆抗体,建立了icELISA、dcELISA、基于AuNPs/Ag-GO纳米复合材料的电化学免疫传感器和基于SPA/Ag-GO纳米复合材料的电化学免疫传感器检测泰妙菌素,添加回收实验证明本研究建立的免疫学检测方法具有较好的准确性,为检测动物源性食品和饲料中泰妙菌素残留提供了可行的方案。
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