扇贝是我国海水养殖业的重要品种之一,但自上世纪九十年代以来,养殖扇贝陆续爆发大规模死亡现象,不但造成了巨大的经济损失,而且严重威胁到了现有产业的可持续发展。从扇贝机体的免疫系统着手,深入研究扇贝的免疫防御机制,探讨提高扇贝抗病力的有效途径和方法,改良种质并培育抗病品系,是保持扇贝养殖业健康可持续发展的必经之路。Toll样受体(TLR,Toll like receptor)是近年发现的一类重要的模式识别受体(PRR,Pattern recognition receptor),在引发固有免疫防御反应,乃至介导获得性免疫防御反应方面都有非常重要的作用,是当今免疫学研究的热点之一。目前对于TLR及其信号通路的研究大都集中于模式生物如果蝇、线虫和脊椎动物特别是哺乳动物中,在无脊椎动物,尤其是海洋无脊椎动物中的研究非常匮乏。本研究以栉孔扇贝为研究对象,对其TLR信号通路的关键成分及功能进行了系统研究。在栉孔扇贝中已陆续发现多个TLR信号通路的关键成分,包括TLR及其接头分子Myd88(Myeloid differentiation primary response gene 88),通路衔接分子TRAF6(TNF receptor associated factor 6),转录因子NF-κB(Nuclear factor kappa-B factor)及其抑制物IκB(Nuclear factor kappa-B factor inhibitor)。通过对这些组分的生物信息学分析,发现这些基因按照从上游到下游的顺序,与其它物种中的对应同源物的相似性呈上升的趋势,且各基因的特征结构域完整而明显。同时利用酶联免疫实验对栉孔扇贝TLR蛋白TIR结构域和MyD88蛋白之间的相互作用进行检测,发现栉孔扇贝TLR蛋白TIR结构域MyD88蛋白之间存在较强的相互作用。因此,栉孔扇贝中的TLR及其通路关键组分构成了迄今为止最为保守且典型的MyD88依赖的TLR信号通路。同时,本研究使用脂多糖(LPS,Lipopolysaccharide)刺激栉孔扇贝,并利用实时荧光定量PCR技术检测栉孔扇贝TLR信号通路相关基因的表达情况,发现这些基因都能够响应LPS刺激,且反应迅速,说明栉孔扇贝TLR信号通路不但在结构上非常保守,而且可以被LPS激活。为了进一步确认栉孔扇贝TLR信号通路是否具有免疫功能,本研究在栉孔扇贝中成功的建立了RNA干扰技术,考察了栉孔扇贝TLR基因的表达被抑制后,机体中溶菌酶和氧化还原系统相关基因表达和相应酶活力的变化,及其对LRR(leucine-rich repeat)基因表达水平的影响。结果表明,栉孔扇贝TLR序列特异性dsRNA可以有效地介导该基因的表达沉默,同时该通路中的其它基因的表达量,也在相应的时相下调,表现为整个TLR信号通路的表达抑制。在这一过程中,超氧化物歧化酶SOD(Super Oxide Dismutase)基因和过氧化氢酶CAT(Catalase)基因的表达量持续高于正常水平,栉孔扇贝血清中的SOD酶和CAT酶比活力的也表现出上调现象,推测栉孔扇贝TLR信号通路对于调控抗氧化基因的表达、清除过量自由基以及维持内环境稳态有重要作用;栉孔扇贝G型溶菌酶基因的表达量以及血清溶菌酶比活力都表现出下调现象,推测TLR信号通路可能参与溶菌酶表达的调控;在扇贝TLR表达抑制的同时,与该基因胞外端具有高度相似性的三个LRR基因的表达量明显上调,表现出明显“代偿”效应。以上结果说明扇贝TLR信号通路很可能影响机体的氧化还原系统和抗菌能力,在扇贝的固有免疫调节过程中发挥着重要作用。为研究栉孔扇贝TLR信号通路在扇贝抵御病原菌感染的作用,本研究结合RNA干扰技术和鳗弧菌攻毒实验,检测鳗弧菌攻毒时栉孔扇贝细胞凋亡水平和累计存活率的变化。研究表明,虽然鳗弧菌刺激导致扇贝细胞凋亡水平大幅提高,但在TLR表达被抑制后,其凋亡水平明显低于其它对照组,推测TLR基因表达被抑制将导致细胞凋亡的信号无法顺利传导。同时,TLR基因被干扰的栉孔扇贝抵御鳗弧菌刺激的能力明显减弱,死亡速率明显高于其他对照组,半致死时间也大大提前,直观的体现了TLR基因在栉孔扇贝抵御鳗弧菌感染机制中的重要作用。这与果蝇中的研究成果不同,果蝇的Toll主要是在对抗革兰氏阳性菌和真菌的感染中发挥作用,本研究的结果证明在低等的海洋无脊椎动物中,TLR信号通路保留着抵御革兰氏阴性菌感染的能力。综上所述,本研究首次在比果蝇更加原始的生物——栉孔扇贝(软体动物)中确定了MyD88依赖的TLR信号通路的存在,并确定该通路在扇贝固有免疫系统,特别是抵御鳗弧菌侵染机制中起着至关重要的作用,其具体机制可能包括调控抗氧化基因的表达、维持内环境稳定以及调控抗菌蛋白基因的表达。