背景和目的:晚期氧化蛋白产物(Advanced oxidation protein products,AOPPs)是一类含双酪氨酸的蛋白质交联产物,于1996年由Witko-Sarsat在尿毒症患者血浆中发现,它是氧化应激过程中由激活的中性粒细胞髓过氧化物酶产生的次氯酸(HC1O)氧化蛋白质(主要为白蛋白)而形成的,主要包含两种不同的分子量:670Kda与67Kda,其特征是酸性条件下在340nm有特异吸收峰。体外用HCIO作用于血浆或血清白蛋白可得到与尿毒症患者血浆中类似的AOPPs。研究证实,血浆AOPPs水平与新喋呤、二酪氨酸、戊糖素等氧化应激标志物呈正相关,与谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化剂呈负相关,被认为是一种良好的氧化损伤的敏感标志物。AOPPs不仅是氧化损伤的标志物,还可作为一类致病介质发挥广泛的病理作用,参与人类多种疾病的发生与发展。慢性肾衰竭患者的血清AOPPs随着肾功能恶化呈进行性升高,升高的AOPPs破坏肾小球滤过屏障,加重蛋白尿、肾小球硬化和间质纤维化。肝硬化患者血清中同样存在AOPPs升高,且酒精性肝硬化血清AOPPs水平与Child-Pugh评分呈正相关。研究发现Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病患者血清AOPPs水平均明显升高,Ⅱ型糖尿病患者的循环AOPPs水平明显高于Ⅰ型糖尿病患者,且AOPPs可能参与糖尿病微血管并发症的发生。Gamian A等研究表明,AOPPs在克罗恩病(Crohn’ s disease, CD)及活动性溃疡性结肠炎患者血清中显著增加,且在CD中AOPPs水平与疾病活动度有关(r=0.42)。CD是一种病因未明的慢性复发性非特异性肠道炎症性疾病,病变主要累及胃肠道,并伴有肠外表现及免疫异常。其主要的病因及病理生理学改变为:环境因素作用于遗传易感者,在肠道菌群的参与下,最终导致固有免疫和适应性免疫紊乱及炎症过程,包括:肠道屏障破坏、小肠上皮细胞凋亡坏死增加、杯状细胞及潘氏细胞功能失调、内质网应激、炎症因子释放、白细胞迁移及滞留、有缺陷的未折叠蛋白反应及自噬、模式识别受体对微生物识别受损、效应和调节性T细胞失衡等。越来越多的研究表明,CD患者体内普遍存在以氧化/抗氧化失衡为特征的氧化应激,作为氧化应激的后果,AOPPs可能是调控CD各种病理生理学改变的重要因素,但是其具体作用及机制尚不明确。小肠上皮细胞(Intestinal epithelial cell,IEC)是覆盖在小肠腔表面的单层柱状细胞,是肠粘膜屏障的主要结构,阻挡肠腔内细菌、毒素等有害物质对肠壁的直接损害。IEC还可以作为非特异性抗原提呈细胞,参与黏膜固有免疫。紧密连接位于单层柱状上皮细胞之间,为一条狭窄的袋状结构,参与肠粘膜屏障的构成,调节细胞旁路转运并维持上皮细胞的极性。紧密连接由多种紧密连接蛋白参组成,最重要的密封蛋白(claudin)、闭合蛋白(occluding)、ZO-1。小肠上皮细胞及细胞间的紧密连接结构和功能的破坏是CD等疾病的重要病理生理改变:(1)IEC的增殖、凋亡和坏死必须严格调控以维持小肠粘膜的完整性,研究表明IEC凋亡、坏死与克罗恩病慢性炎症有关,是CD的重要病理生理变化。(2) IEC参与粘液分泌有关的基因突变(如MUC1、MUC19、PTGER4等),导致其分泌的粘液减少,粘膜屏障功能减弱。(3)在CD中,由于紧密连接蛋白表达降低、重分布等导致紧密连接破坏,渗透性增加,肠腔内有害物质渗入固有层,直接损害肠壁。AOPPs水平在CD患者血清中显著升高,但其具体作用尚不明确,是否调控小肠上皮细胞增殖、凋亡?是否破坏小肠上皮紧密连接?因此,本研究完成以下三个研究目标:(1)证实AOPPs诱导小肠上皮细胞凋亡及损伤的病理作用;(2)探讨AOPPs对小肠紧密连接蛋白的作用;(3)明确AOPPs作用的机制。材料和方法:1.无内毒素AOPPs的制备和鉴定。按照Wittko-Sarsat等介绍的方法,将20mg/mL无内毒素大鼠白蛋白(RSA)与40mmol/L次氯酸(HClO)按等体积混合,室温孵育30min,即制备出RSA:次氯酸摩尔比为1:140的AOPPs。制备的AOPPs在无内毒素用磷酸盐缓冲液(PBS)中透析24h,除去游离的次氯酸。用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后-20℃保存。20mg/mLRSA与PBS等体积混合,作为对照。AOPPs含量测定:以不同浓度氯胺T制备标准曲线,测定酸性条件下340 nm处吸光值。通过鲎试验法检测,该方法制备的AOPPs无内毒素。2.细胞培养。大鼠小肠隐窝上皮细胞(IEC-6)、肠上皮Caco-2细胞株购自上海细胞库。培养条件:用含10%胎牛血清的DMEM培养基置于37℃、5%CO2细胞培养箱,待细胞生长至80%融合时用于实验。3.细胞增殖。细胞接种于96孔培养板,每孔接种4000个细胞,过夜细胞贴壁后,每孔分别加入RSA、不同浓度的AOPPs来干预细胞,按照CCK-8试剂盒的方法,采用紫外分光光度仪分别检测加入刺激因素前及刺激后24h的光密度值。4.细胞凋亡检测。流式细胞仪检测细胞凋亡率IEC-6细胞以5×105/孔种于6孔细胞培养板,培养24h后换无血清DMEM培养基培养过夜,使细胞同步于G0期,分组如下:(1)以0, 200μg/mL RSA,50, 100, 200, 400μg/mLAOPPs 刺激 48h; (2)以 200μg/mLAOPPs 刺激 0, 24,48,72h; (3)抑制剂分别采用DPI、apocynin、SOD于37℃预先孵育60min,后以200μg/mLAOPPs刺激48h;用AnnexinV-FITC/PI双染,流式细胞仪激发波长488nm,发射波长525nm检测细胞凋亡率。DAPI染色检测细胞核形态学变化IEC-6细胞种于24孔细胞培养板,细胞贴壁后换无血清DMEM培养基培养过夜,使细胞同步于GO期,以20μg/mLAOPPs刺激0, 24, 48, 72h,刺激结束,采用DAPI染核,荧光显微镜观察DAPI蓝色荧光,立即拍照,存像。TUNEL检测小肠组织原位凋亡组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、PBS洗涤、多聚甲醛固定、再洗涤、蛋白酶K通透后,加入rTdT酶和FITC-dUTP混合物,DAPI复染,激光共聚焦显微镜观察FITC绿色荧光和DAPI蓝色荧光,拍照存像。5. NADPH氧化酶的活化。p47phox的膜迁移IEC-6 接种于 24 孔板,分别用培养基、200μg/mLRSA、200μg/mLAOPPs、AOPPs+apocynin刺激60min,间接免疫荧光法染色p47phox,DAPI复染细胞核,荧光显微镜观察p47phox膜迁移。p47phox磷酸化的检测IEC-6 接种于 6 孔板,用 200μg/mLAOPPs 刺激 0, 5, 15, 30, 60, 120min,收集细胞总蛋白。经免疫沉淀Phosphoserine或p47phox后,用WB检测p47phox蛋白含量。p47phox,p22phox,gp91phox 表达IEC-6 接种于 6 孔板,用 200μg/mLAOPPs 刺激 0,1,3,6,12, 24h,提取细胞总蛋白,WB检测p22phox、p47phox和gp91phox的表达。6.IEC-6细胞内活性氧(ROS)的检测。IEC-6接种于6孔板,培养24h后换无血清DMEM培养基培养过夜,使细胞同步于G0期,分组如下:(1)以培养基,200μg/mLRSA, 50,100, 200,400μg/mLAOPPs 刺激 3h; (2)以 200μg/mLAOPPs 刺激 0, 5, 30, 60, 120min;(3)抑制剂分别采用DPI、apocynin、SOD于37℃预先孵育60min,后以200μg/ml AOPPs刺激3h,装载DCFH-DA探针,流式细胞仪检测DCF荧光。7. Western blotting (WB)检测。细胞经AOPPs、RSA、各组抑制剂等刺激后,提取细胞总蛋白,采用化学发光法检测 MAPK、PARP-1、PAR、casepase-3、cleaved Casepase-3、AIF、β-actin、ZO-1、occludin、claudin-1 等蛋白的表达。8.核浆分离。使用武汉碧云天公司提供的细胞核浆分离提取试剂盒。6孔板的细胞经PBS洗涤及细胞刮刮取收集之后,离心,弃上清,细胞沉淀用细胞浆提取缓冲液(含DTT及蛋白酶抑制剂)于冰上孵育1Omin,加入细胞裂解液冰上作用1min,4℃ 12,000-16,000g离心5min后收集上清即得到细胞浆蛋白。收集沉淀,加入细胞核蛋白抽提试剂,震荡,冰浴30min, 4℃ 12000-16000g离心10min,收集上清即为细胞核蛋白。9.免疫荧光检测。将细胞悬液种于24孔板,待细胞贴壁并经AOPPs处理后,予多聚甲醛固定、Triton X-100 透膜、5% BSA 封闭、一抗孵育:(AIF、occludin、ZO-1、claudin-1 )。二抗避光孵育、DAPI染核及荧光显微镜下观察,拍照。10.检测单层细胞的通透性及上皮跨膜电阻抗(TEER,transepithelial electrical resistance)值。每个transwell小室的上室种植2.0×106个细胞,分别于上室和下室中加入培养液200μL和600μL。取不同的3个点,利用EVOM细胞电位仪测量细胞跨膜电阻抗(TEER),将细胞电阻仪电极的短臂和长臂分别插入上室和下室测定TEER,取平均值。待TEER达300Ω/cm2后,分别用不同浓度AOPPs处理不同时间,观察TEER的变化。采用Fitc～daxtran测单层细胞的通透性。11.动物实验。雄性正常SD大鼠(购自南方医科大学实验动物中心),体重160-200g,在恒温清洁环境(南方医科大学实验动物中心)饲养,自由进食及饮水,随机分为4组,每组6只,作如下处理:①溶剂组:等体积PBS,腹腔注射,每日一次。②未修饰的RSA组:50mg/kg体重,腹腔注射,每日一次;③AOPPs-RSA 50mg/kg体重,腹腔注射,每日一次;④AOPPs-RSA50mg/kg体重,腹腔注射,apocynin50mg/kg体重,灌胃,均每日一次,按照该剂量注射,可大鼠血浆AOPPs水平比正常大鼠增高0.5倍左右(相当于CD患者血清AOPPs的浓度)。于注射12周时处死大鼠取材。大鼠经七氟醚麻醉后,迅速取出小肠及大肠组织。部分肠组织中性福尔马林固定,石蜡包埋,3μm切片,进行HE染色、免疫荧光及免疫组化等检测。部分肠组织迅速放于液氮中,以提取蛋白,进行WB检测。12. HE染色、PAS染色、AC染色及免疫组化。大鼠小肠组织标本经脱蜡、水化处理后,予HE染色以判断AOPPs处理前后小肠的病理改变。经PAS染色及AC染色以检测杯状细胞数量的变化。小肠组织标本经脱蜡、水化及抗原修复、阻断过氧化物酶及血清封闭后,孵育AOPPs、gp91phox、p22phox、p47phox、p-JNK、PARP-1、PAR、AIF一抗及相应的二抗,最后经DAB染色,验证以上各蛋白表达情况。13. CD患者标本收集及处理选择2010年01月至2012年12月2年间在南方医院多次住院治疗并确诊为克罗恩病经手术切除的小肠标本(共23例)。含有溃疡、肉芽肿等病变部位进行组织学检测,以远端无明显病变的小肠组织作为对照(经南方医院病理科证实为基本正常的组织)。用于小肠CD患者AOPPs表达、小肠上皮细胞凋亡及二者的相关性分析。采用回顾性调查方法,记录并统计每例患者的一般情况、临床表现、实验室检查结果以及病理或手术记录等。14.统计学方法所有实验均重复3次或3次以上,结果以均数±标准差表示,所有统计结果应用统计软件SPSS13.0完成。多个样本均数的比较采用One-WayANOVA,在比较前先计算方差齐性,当方差齐时两两比较采用LSD法,方差不齐时采用DunnettsT3法,当p<0.05时为具有统计学差异。患者小肠组织AOPPs染色强度与凋亡细胞数量相关性采用Spearman’ s相关分析。结果:1.AOPPs抑制体外培养的小肠上皮细胞(IEC-6)增殖CCK-8实验显示,AOPPs抑制了 IEC-6细胞增殖,随着浓度的增加AOPPs对细胞增殖的抑制作用越显著,经统计学分析表明:3个实验组与对照组比较存在差异,而且差异具有显著性(F=26.017, P<0.001)。2. AOPPs诱导小肠上皮细胞凋亡AOPP刺激IEC-6细胞后,随着刺激时间的延长,DPAI染色显示细胞逐渐出现核浓缩、核碎裂等凋亡表现。流式细胞术检测显示,AOPPs呈现时间和剂量依赖性诱导小肠上皮细胞凋亡。3. AOPPs激活IEC-6细胞内NADPH氧化酶系统在AOPPs刺激下,IEC-6细胞内NADPH氧化酶亚单元p47phox快速磷酸化,磷酸化在AOPPs刺激5min后开始,并在30min时最明显,空白对照组及未修饰的RSA组未见到此效应。免疫荧光染色发现AOPPs促进p47phox的膜迁移,AOPPs刺激15min时可见明显的p47phox的膜迁移,而RSA刺激组未见到此效应,apocynin可抑制AOPPs促膜迁移的效应。此外,AOPPs刺激1-3h后明显增加了p22phox、p47phox、gp91phox亚基蛋白表达,刺激24h仍处于高水平。4. AOPPs升高NADPH氧化酶依赖性的ROSAOPPs刺激IEC-6后能显著促进细胞内ROS的生成。AOPPs呈浓度依赖性促进细胞内ROS的产生,4000μg/mL时达对照组的近3倍(P<0.001)。IEC-6细胞内的ROS水平随着AOPPs刺激时间的延长逐渐升高,刺激2h后,ROS达对照组的2倍(P<0.01)。未被修饰的RSA对ROS的产生无显著影响(P>0.05)。使用NADPH氧化酶抑制剂DPI,apocynin以及ROS清除剂与IEC-6细胞预孵育显著降低了 AOPPs提升IEC-6细胞ROS的水平(和AOPPs组比,P<0.05)。5. AOPPs诱导IEC-6细胞内JNK磷酸化WB实验显示,AOPPs刺激IEC-6细胞30min后,JNK发生明显的磷酸化,磷酸化效应可持续至3h (差异有统计学意义,P<0.01)。而空白对照组及未修饰RSA组无此效应。6.AOPPs通过NADPH氧化酶-ROS-JNK途径上调PARP-1的表达经典的依赖caspase-3途径与新近发现的由PARP-1介导的非依赖性caspase-3途径是炎症损伤、氧化应激相关的凋亡及坏死下游转导通路。前者以caspase-3前体(35Kda)降解为裂开的caspase-3 (17Kda和19Kda)为特征。后者以PAR形成、NAD+消耗、胞浆AIF向胞核转位为主要特征。为了探讨AOPPs诱导IEC-6细胞凋亡的下游信号通路,我们采用wesetem检测了 AOPP-RSA刺激前后 procaspase-3、cleaved caspase-3、PAR及 PARP-1 的表达变化。结果显示,113Kda的全长PARP-1在200μg/mL的AOPPs-RSA刺激后1h即增加,6h达顶峰,24h仍处于高水平,同时伴随着85Kda的PARP-1断裂带出现。PAR蛋白表达的变化与PARP-1基本一致。采用核浆分离提取,我们发现AOPPs刺激后,IEC-6细胞核中AIF显著增加。而伴随着PARP-1的增加与PAR的形成,细胞内NAD+的浓度下降。此外,35Kda的caspase-3前体在AOPP-RSA刺激1～24h出现裂解,并伴随着17Kda的裂解型caspase-3的增加。在AOPPs刺激前,用NADPH氧化酶抑制剂(DPI和apocynin)、ROS清除剂(SOD)和JNK特异抑制剂(SP600125)预孵育1h后或者与IEC-6细胞一直共孵育,WB检测显示各组抑制剂均能显著抑制AOPPs对PARP-1的上调作用,当抑制剂持续存在于AOPPs的作用过程时,抑制作用更为显著。7. AOPPs促进大鼠小肠上皮细胞凋亡,apocynin阻断AOPPs效应上面我们已经证实AOPPs能够诱导IEC-6细胞凋亡,为了验证在体内AOPPs增加能否诱导小肠上皮细胞凋亡,我们以SD大鼠为研究模型,应用原位TUNEL标记法检测凋亡的小肠上皮细胞。12周后,AOPPs注射组较未修饰RSA、PBS组凋亡的小肠上皮细胞数显著增加,NADPH氧化酶抑制剂apocynin可减弱AOPPs的促凋亡效应。8. AOPPs慢性负荷导致大鼠小肠杯状细胞减少小肠上皮覆盖在小肠表面,由吸收细胞、杯状细胞、干细胞、潘氏细胞及内分泌细胞构成。为了进一步探讨AOPPs对小肠上皮细胞凋亡的后果,我们验证了 AOPPs处理后杯状细胞的变化。糖原染色(Periodic Acid-Schiff staining,PAS staining)、阿利新蓝染色(Alcian blue staining,AC staning)均显示 AOPPs长期负荷导致杯状细胞减少,差异有统计学意义(P<0.05)。9. AOPPs 组大鼠 NADPH-ROS-JNK-PARP 被激活小肠切片组织学检测显示AOPPs沉积在小肠隐窝与绒毛顶端的上皮细胞、固有层的淋巴细胞。为了验证在体内AOPPs能否激活NADPH氧化酶,对大鼠小肠组织采用免疫组化原位检测及对小肠上皮匀浆蛋白进行Western blotting分析。结果显示AOPP-RSA注射组NADPH氧化酶各亚基p22phox,p47phox,and gp91phox表达均上调。而NADPH氧化酶抑制剂apocynin可以明显阻断该效应。为了验证AOPPs对JNK-PARP-1通路的激活作用,我们采用免疫组化检测了磷酸化JNK、PARP-1、PAR、AIF的表达。AOPPs组较生理盐水组、RSA组显著激活了 JNK,增加了 PARP-1、PAR的表达,并诱导AIF从细胞浆向胞核转位。10. AOPPs慢性负荷诱导炎细胞浸润和小肠上皮损伤对小肠及大肠切片系统的组织学评估显示:AOPPs可导致小肠发生如下病理变化:①小肠绒毛变短;②固有层及粘膜下层有大量的淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞等炎细胞浸润;③淋巴滤泡增生;④上皮层坏死及剥脱;⑤小肠粘膜糜烂。而apocynin能够改善上述病理改变。11. CD患者小肠病变上皮细胞中AOPPs沉积与细胞凋亡呈正相关收集CD患者经手术切除的小肠组织,采用免疫组化检测AOPPs在小肠病变组织中(糜烂、溃疡、透壁性炎症及肉芽肿病变等)的表达情况,用TUNEL检测小肠上皮细胞的凋亡。以病变远端的正常小肠组织作为对照。结果显示AOPPs主要沉积在病变处的小肠上皮细胞及固有层的炎症细胞中,而在对照组中沉积较少。TUNEL阳性的细胞主要位于病变组织中。此外,AOPPs染色强度与小肠上皮细胞凋亡呈正相关。(r=0.568, P<0.01)12. AOPPs下调体外培养的Caco-2细胞紧密连接蛋白occludin、claudin-1、ZO-1的表达Caco-2细胞由于其在培养条件下可自发进行上皮样分化并可形成紧密连接,其形态学、渗透特征等与小肠类似,因此,常作为研究肠粘膜屏障的模型。未经处理的Caco-2细胞中紧密连接蛋白occludin、claudin-1、ZO-1分布在细胞与细胞连接处,形态完整,表达量高。随着AOPPs刺激浓度的增加与刺激时间的延长,紧密连接蛋白的表达逐渐降低。免疫荧光显示occludin、ZO-1在细胞膜上的表达密度降低,分布不连续,甚至大量缺失。AOPPs处理后Caco-2细胞TEER值较对照组显著下降(P<0.01 ),通透性显著升高(P<0.01)。13. AOPPs通过激活ERK1/2-MAPK信号通路破坏紧密连接AOPPs 刺激 Caco-2 细胞 15min 后 ERK1/2、JNK-MAPK 开始磷酸化,20min达最高峰,可持续至60min,之后逐渐降至未处理水平。为了进一步明确AOPPs是否通过激活ERK1/2或JNK破坏紧密连接,我们分别使用ERK1/2抑制剂U0126或JNK抑制剂SP600125预孵育Caco-2细胞,再观察AOPPs对紧密连接蛋白表达的影响,ERK1/2抑制剂U0126能够抑制AOPPs对紧密连接蛋白的下调作用(P<0.01 ),而JNK抑制剂不能抑制AOPPs的下调作用。结论:1. AOPPs以时间和剂量依赖性的方式诱导小肠上皮细胞的凋亡。2. AOPPs通过诱导NADPH氧化酶依赖性的ROS生成,激活ROS敏感的JNK通路,上调PARP-1的表达,后者导致NAD+消耗、PAR形成及AIF核转位,最终引起细胞凋亡。3.动物学实验证明AOPPs诱导小肠上皮细胞凋亡,引起杯状细胞减少,并导致小肠组织炎细胞浸润和损伤。NADPH氧化酶抑制剂apocynin干预可以阻断AOPPs导致的小肠上皮凋亡和损伤效应。4. AOPPs在CD患者病变组织中沉积,并且与小肠上皮细胞凋亡呈正相关。5. AOPPs通过激活ERK1/2-MAPK信号通路下调紧密连接蛋白occludin、ZO-1及claudin-1的表达,破坏小肠上皮紧密连接,使其渗透性增加。