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黄曲霉毒素可由多种曲霉属真菌产生,主要为黄曲霉和寄生曲霉。黄曲霉毒素,尤其是黄曲霉毒素B1(AFB1),是包括人类,鸟类,猪,鱼类和啮齿类动物等许多动物的强力致毒物质。肝脏是AFB1损害最为重要的靶器官,AFB1诱导肝脏细胞损害和其中的DNA、蛋白质及脂质的损伤,并导致癌症发生,由AFB1引起的氧化应激可能是其中一个潜在机制之一。关于硒对于黄曲霉毒素致机体损伤的缓解作用,学界已进行了一些体内实验研究并取得了很多重要成果。但是对于硒对动物黄曲霉毒素中毒的缓解作用及机理仍有待进一步研究。本文在建立了鸡原代肝脏细胞培养方法的基础上,研究了黄曲霉毒素致鸡原代肝细胞的损伤作用,并进一步研究了不同浓度的亚硒酸钠、硒蛋氨酸对黄曲霉毒素损伤细胞的影响,同时从黄曲霉毒素代谢角度对硒缓解中毒细胞损伤的机理进行了探讨。具体研究内容如下:1.建立鸡原代肝脏细胞的培养方法。优化了传统的胶原酶灌注消化法,改良了灌流液配方和成分,使用循环灌流方法,对成年黄羽鸡进行肝细胞分离,用台盼蓝拒染法观察并计算肝细胞总数和实时存活率。使用了 Williams’medium E、DMEM、1640和L-15四种基础培养基进行培养和对比,以5×105个/ml的密度接种于96孔细胞板,在37℃C C02培养箱中进行培养,并观察细胞形态,使用Mtt法测定肝细胞生长曲线。结果显示,每个肝脏获得的肝细胞总量为(9.2±0.2)×108个,以台盼蓝拒染实验得到肝细胞实时存活率为93%±1%;不同的培养基相比较,发现Williams’ medium E培养基贴壁情况最好,DMEM和L-15次之,1640略差;在长期培养过程中发现DMEM培养基中细胞稳定周期长,可长期培养2-3周;通过MTT法得到8天内细胞的生长曲线,肝细胞接种48h后趋于稳定,并在72-120h区间内保持良好的细胞活性,适于进行药物代谢及毒性实验。2.探索黄曲霉毒素致鸡原代肝细胞损伤作用及硒对毒素损伤原代肝细胞的影响。分离的肝细胞以5×105个/ml的密度接种于96孔细胞板,48h后用含0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6ug/mlAFB1的培养液换液,培养24h后,分别收集各个组培养液,测定ALT、AST,并用MTT法测定细胞增殖情况。并用MTT法摸索两种硒的安全浓度及硒对毒素损伤细胞活率的影响。结果显示,综合AST、ALT及Mtt结果,0.05μg/ml的毒素浓度作为诱导肝细胞损伤的最佳剂量;Na2Se03浓度达到5μmol/L时,对鸡肝细胞的生长产生了显著的抑制,SeMet则安全许多,当浓度提升至20μmol/L时,才对肝细胞的生长产生显著抑制;1、2μmol/L浓度的Na2Se03和2、4μmol/L浓度的SeMet能够显著提高毒素损伤细胞活率。3.研究了 Na2Se03及SeMet对AFB1致损伤鸡肝细胞氧化还原指标的影响。细胞以5×105cell/ml接种于6孔细胞培养板,培养48h后,使用含0、0.5、1、2、4μmol/L Na2Se03或SeMet的培养液换液,培养24h后,换含0.05 ug/ml AFB1的培养液,培养24h,收取细胞,测定胞内SOD、GSH、MDA水平。结果显示,0.5、1μmol/L的Na2Se03能够显著提高毒素损伤肝细胞的SOD水平,2、4mol/L的Na2Se03对毒素损伤细胞的SOD水平并无显著影响。而0.5、1、2、4 μmol/L的SeMet均对毒素损伤细胞的SOD水平有显著的升高作用;无论Na2Se03还是SeMet,与对照组相比较,也能引起细胞内GSH水平的下降。两种硒预处理的AFB1损伤组的GSH同AFB1损伤组亦有显著下降;单独加入Na2Se03,细胞内MDA含量并无显著变化。加入AFB1后,Na2Se03预处理的细胞内MDA含量与毒素对照组比较,除1μmol/L浓度组外也没有显著差异。而对于SeMet预处理的毒素组,其MDA含量在SeMet浓度为2μmol/L和4μmol/L时,与毒素对照组相比,MDA含量显著下降。4.对不同硒源对AFB1诱导的鸡肝细胞损伤的缓解作用机理进行了探讨。同氧化还原指标测定相同设计和分组,采用荧光定量PCR检测CYP450 1A5和CYP450 3A37 mRNA的表达。Western blot检测SeMet对肝细胞及毒素损伤肝细胞中CYP450 1A5蛋白表达水平的影响。结果显示,加入不同浓度的硒均能使CYP450 1A5mRNA水平下降,且SeMet下调效果更稳定,而对于CYP450 3A37 mRNA的表达,硒无明显影响;各个浓度的SeMet均能引起肝细胞内CYP450 1A5蛋白表达的下降,SeMet对毒素损伤细胞内CYP450 1A5蛋白表达也具有显著下调作用,其中,2μmol/L浓度的SeMet下调作用最为显著。