第一部分人喉癌细胞系Hep-2膜抗原的分析及喉癌干细胞标志的初选背景喉癌是仅次于肺癌的第二大呼吸道高发癌，功能性微创手术、放射治疗、化学药物及生物治疗、基因治疗等综合性治疗措施的共同应用，已使患者的5年生存率及生活质量大大提高。但喉癌的复发、转移，对放疗不敏感及化疗药物耐受等问题，常使治疗效果欠佳，术后残喉复发及颈部淋巴结转移，仍是患者致死的主要原因，传统方法无力解决这些问题，迫切需要从新的视角解释从而解决这些问题。近年来的肿瘤干细胞（Tumor stem cells TSCs）学说认为肿瘤组织中存在着极少量瘤细胞，在肿瘤中充当干细胞的角色，具有无限增生的潜能，在启动肿瘤形成和生长中起着决定性的作用，而其余的大多数细胞，没有或者只有有限的增殖能力，经过短暂的分化，最终死亡。干细胞就是肿瘤细胞群中，一类具有高的增值能力和自我更新能力的分化上游细胞。本研究旨在分析喉癌细胞系Hep-2细胞膜蛋白的表达差异，说明喉癌细胞组成的不均一性，探讨喉癌干细胞存在的可能。方法以人喉癌细胞系Hep-2为研究对象；应用免疫荧光细胞化学技术及流式细胞技术检测候选干细胞标志CD133、CD44在细胞膜中的表达。结果1、免疫细胞化学示Hep-2细胞中CD133呈低度表达、CD44呈高表达。2、流式细胞术示Hep-2细胞中CD133微量恒定表达，表达概率3.15％±0.83％；CD44表达概率为97.12％±1.9％。结论Hep-2细胞中候选干细胞标志CD133呈微量恒定表达。第二部分人喉癌Hep-2细胞系各亚群的纯化及体外增值能力实验（一） CD133阳性细胞群的分选背景CD133是新近在干细胞研究领域极为活跃的细胞表面标志之一，常表达于未成熟的造血干／祖细胞，随着细胞的分化，其在细胞表面的表达迅速减少。最近有报道认为，它也是非造血系统干细胞的标志，如神经干细胞，胚胎干细胞系和成人具有多分化潜能的干细胞。已证明它是脑肿瘤干细胞的特异性标志，新近发现在前列腺癌中也有表达。目前干细胞的分选方法主要是流式细胞仪分选技术和免疫磁珠分选技术，已知CD133在喉癌细胞系Hep-2中微量恒定表达，本部分目的在于探讨免疫磁珠分选技术纯化CD133阳性细胞的可行性。方法利用免疫磁珠分选技术纯化Hep-2中CD133⁺细胞，分选前，流式细胞术测试CD133⁺细胞的百分比；纯化后，再次测试所得细胞中CD133⁺细胞的百分比，以评价分选的效益和分选方法的可行性。结果利用免疫磁珠分选技术纯化Hep-2中CD133⁺细胞，分选前，流式细胞术测试CD133⁺细胞的百分比，为3.15％±0.83％；分选后CD133⁺细胞的百分率为90.26％±7.61％，后继的实验证明细胞生长良好，显示应用MiniMACS分选技术，得率高，且不影响细胞的活性。结论免疫磁珠分选技术用于CD133⁺细胞的纯化，富集浓度高，分选后的细胞活性良好，是一种理想的干细胞分选方法。（二）人喉癌Hep-2细胞系各亚群体外增值及分化能力实验背景研究表明，肿瘤干细胞是一类具有永生或无限自我更新能力的肿瘤细胞，它们能够产生至少一种类型的、高度分化的子代肿瘤细胞，他们在发育期间能够通过对称性分裂以扩增数量，或者通过非对称性分裂进行自我更新和产生更多不同分化类型的祖细胞。与其他干细胞的特征相似，多分化潜能和自我更新能力也是肿瘤干细胞的基本特点。干细胞的增殖离不开它们赖以生存的niche，干细胞的niche，即小生态环境（简称“小生境”）是支持干细胞的特殊的微环境，其作用是滋养干细胞并保持干细胞的稳定态（homeostasis）。从正常干细胞与其niche的关系，可以推测肿瘤干细胞的存活、增殖和分化像正常干细胞一样，受到其相应的niche的支持与调控；在肿瘤干细胞，niche似乎还是保护和支持癌的发生发展必要的结构与功能单元。这是因为它们平时多处于G₀／G₁期，只有在相关细胞因子的诱导下才能进入细胞周期，参与细胞的扩增。本研究拟比较离体Hep-2细胞系各亚群的体外增值和分化能力。方法分选的CD133⁺细胞、CD133^-细胞、未分选细胞种植与同一96孔板上，在1、3、5、7天用MTT比色法测定细胞的增殖状态，绘制细胞生长曲线，比较三组细胞的增殖速度；分选后CD133⁺阳性细胞在培养的0、4、8、12天用流式细胞仪动态测试CD133⁺细胞在培养体系中的百分比，以评估其分化能力。结果生长曲线表明，CD133⁺Hep-2细胞有强的体外扩增能力，曲线陡直，在1-3天和5-7天更见显著，未分选细胞、CD133^-细胞的生长曲线较为平坦，示体外增殖能力较弱。纯化后CD133阳性细胞体外培养，随着扩增时间的延长，CD133⁺细胞在培养体系中的比例逐渐下降，至扩增的第12天，由最初的90.37％±2.37％下降至4.76％±0.75％，与分选前比率相当。结论CD133⁺细胞群的增殖能力明显大于CD133^-细胞群和未分化细胞；CD133⁺细胞群有自我更新的能力，又具有重新生成其他表型细胞的特性，与干细胞的特征相符合。第三部分SCID小鼠模型的建立及人喉癌Hep-2细胞系各亚群体内成瘤能力的检测背景试验证明肿瘤中干细胞数目虽然稀少，但致瘤能力明显强于普通肿瘤细胞。其致瘤性因肿瘤种类不同差别较大，主要表现在在免疫缺陷动物体内的肿瘤形成（tumorigenicity）能力，即将分选的相同数量的肿瘤干细胞和肿瘤非干细胞分别原位或异位接种免疫缺陷动物，肿瘤干细胞的成瘤性较非干细胞强。传统上人原生实体瘤干细胞的异种移植检测是在裸鼠中进行，这些小鼠仍然具有一定的免疫功能，对检测实体瘤干细胞的存在有影响。本实验应用SCID（Severe Combined Immune Deficiency重症联合免疫缺陷）小鼠作为负瘤对象，研究CD133⁺细胞在体内的致瘤能力。SCID小鼠是一种严重缺乏T细胞和B淋巴细胞的免疫缺陷小鼠，该小鼠缺乏有效的细胞免疫和体液免疫功能，是研究干细胞的较为理想的动物模型。为排除Hep-2各亚群的成瘤能力差异由细胞生长状态和细胞周期的分布不同而引起，本实验在进行动物实验之前，对分选细胞进行了体外生长状况观察和细胞周期的分析。方法免疫磁珠分选技术纯化CD133⁺肿瘤细胞，分选细胞体外培养，HE染色观察生长状况；流式细胞仪测试各亚群细胞的周期分布情况；CD133⁺肿瘤细胞、CD133^-肿瘤细胞以及未分选以一定的数量级注入SCID小鼠腹部皮下，比较它们在体内的成瘤能力，统计学处理实验数据。结果免疫磁珠富集的CD133⁺肿瘤细胞体外培养具有肿瘤细胞形态；流式细胞仪分析其细胞周期分布与来源Hep-2细胞相仿，非细胞周期特异性细胞群；CD133⁺肿瘤细胞在SCID小鼠体内具有强的成瘤潜能。结论在体内成瘤性方面，Hep-2具有不均一性。相对于非CD133⁺亚群，CD133⁺数目稀少，且不处于细胞周期的优势分裂像，也非细胞群体中的异源细胞或非肿瘤细胞，但与未分选细胞相比，有强的体内成瘤性。因此，CD133被认为是喉癌细胞系Hep-2的肿瘤干细胞标志之一。