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目的:特应性皮炎（atopic dermatitis,AD）是一种慢性炎症性皮肤病,其特点是反复出现的皮疹和剧烈的瘙痒,影响患者睡眠、生活质量及身体和精神健康。AD的病因和发病机制复杂,至今尚未完全明了,遗传因素、环境因素、免疫失常、皮肤屏障功能障碍等均与AD发病相关。而对于AD治疗,近年随着以Dupilumab为代表的生物制剂的应用,为AD患者的治疗寻找到了更有效的方法,但目前AD的复发性和顽固性仍是目前临床上经常遇到的难题。因此进一步寻找AD发病机制,对临床治疗可以提供新思路。AD是复杂免疫介导的炎症性疾病,存在屏障功能破坏和微生物或过敏原的渗透侵入。炎性小体是由核苷酸寡聚化结构域样受体组装而成的多蛋白复合物,在病原体识别和炎症反应中起着重要作用。目前越来越多的证据表明,炎性小体参与了AD的炎症反应。而这其中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3）炎性小体报道较多。在大多数细胞中,NLRP3由TLR/NF-κB信号启动激活,激活后随即诱导半胱氨酸蛋白酶caspase-1活化,活化的caspase-1迅速剪切促炎因子IL-1β和IL-18的前体形式,使其成熟并分泌到细胞外,诱发强烈的免疫反应。此外活化的caspase-1可以切割消皮素D（Gasdermin D,GSDMD）,释放其N端结构域,在细胞膜上形成孔隙,诱导细胞焦亡。细胞焦亡是由炎性小体激活介导的促炎性程序性细胞死亡,有研究显示:在角质形成细胞中激活NLRP3炎性小体,随之释放IL-1家族蛋白可能是AD的危险因素,NLRP3炎性小体介导的细胞焦亡在AD发病机制中起作用。因此,抑制NLRP3炎性小体可能是一种新的治疗AD的方法。动力相关蛋白1（dynamin-related protein 1,Drp1）属于动力蛋白家族成员,是调节线粒体分裂的关键蛋白,在细胞应激反应中,细胞质Drp1被转位到线粒体中并促进线粒体分裂,参与线粒体功能障碍的发生发展。线粒体分裂和融合过程形成动态网络,动态网络的平衡维持线粒体的正常形状和功能。动态网络失衡可导致线粒体功能障碍。研究表明,线粒体过度分裂与许多疾病有关,如神经退行性变、肝脏缺血-再灌注损伤和炎症性气道疾病等。有研究发现,Drp1的激活诱导了线粒体分裂,进而通过caspase-1依赖性方式导致了NLRP3炎性体介导的心肌细胞焦亡;调控线粒体动力学可减少NLRP3相关细胞焦亡,发挥抗动脉粥样硬化作用。这些研究提示Drp1参与调控NLRP3炎性小体介导的细胞焦亡。但在AD发病中Drp1是否参与NLRP3炎性小体介导的细胞焦亡尚不清楚。目前仅有资料显示:Drp1在AD患者皮肤中的表达较健康对照者显著升高;抑制Drp1活性或下调Drp1表达可抑制肥大细胞线粒体转位、脱颗粒和肿瘤坏死因子分泌。因此本研究通过细胞及动物实验研究Drp1抑制对线粒体功能、NLRP3激活及细胞焦亡的影响,进一步阐明AD发病机制,明确Drp1是否可以作为临床药物治疗靶点,为临床新药研发提供新思路。研究方法:首先应用AD样炎性混合物[polyinosinic–poly-cytidylic acid（10ng/ml）,TNF-α（10 ng/ml）,IL-4（50 ng/ml）,IL-13（50 ng/ml）]诱导人表皮角质形成细胞（human epidermal keratinocytes,HEKs）,采用Drp1选择性抑制剂Mdivi-1处理HEKs,Western blot检测Drp1、磷酸化动力相关蛋白1（phosphorylation dynaminrelated protein 1,p-Drp1）、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis associated speck like protein,ASC）、细胞焦亡相关指标Gasdermin D-NT、caspase-1、IL-1β,IL-18的表达,可见分光光度法检测乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）水平,Western blot及免疫荧光检测NF-κB信号活性,流式细胞仪检测活性氧（reactive oxygen species,ROS）释放,Western blot检测线粒体分裂融合相关指标线粒体融合蛋白1（mitofusin1,Mfn1）、线粒体融合蛋白2（mitofusin2,Mfn2）、视神经萎缩相关蛋白1（optic atrophy 1,Opa1）的表达;同时将靶向Drp1的si RNA转染到角质形成细胞中,应用AD炎性混合物进行干预,通过RT-q PCR检测Drp1的表达,应用Western blot检测转染后Drp1、NLRP3、ASC及Gasdermin D-NT的表达,初步明确在AD样炎性混合物诱导的角质形成细胞中Drp1抑制对线粒体分裂、NLRP3炎性小体活化及细胞焦亡的影响,明确相关信号通路。然后采用二硝基氯苯（2,4-dinitrochlorobenzene,DNCB）诱导建立AD小鼠模型,腹腔注射Mdivi-1进行干预,实验末观察小鼠抓挠皮肤次数,进行皮炎评分,ELISA检测Ig E及AD相关炎性因子IL-4、IL-5、IL-13水平变化,结合HE染色分析小鼠皮损组织病理改变,甲苯胺蓝染色分析小鼠皮损组织中肥大细胞浸润情况,明确Drp1抑制对AD的治疗作用。同时在DNCB诱导的AD小鼠模型中应用RTq PCR检测Drp1表达,Western blot检测Drp1、p-Drp1、NLRP3/细胞焦亡相关指标表达变化,可见分光光度法检测LDH水平,Western blot及免疫荧光测定NF-κB信号活性,Western blot检测Mfn1、Mfn2、Opa1的表达,阐明Drp1抑制对AD作用的相关机制。结果:1.AD样炎性混合物诱导的角质形成细胞中p-Drp1表达升高。2.Drp1选择性抑制剂Mdivi-1可以使AD样炎性混合物诱导的角质形成细胞中细胞焦亡相关指标NLRP3、ASC、活化caspase-1、GSDMD-NT、IL-1β和IL-18表达降低;LDH水平降低;p65和IκBα磷酸化水平降低,P65入核减少;线粒体融合相关蛋白Mfn1,Mfn2和Opa1表达升高;ROS释放减少。3.靶向Drp1的si RNA转染到角质形成细胞后,Drp1的表达降低,下调Drp1可降低AD样炎性混合物诱导的角质形成细胞中LDH水平,降低NLRP3、ASC、GSDMD-NT的表达。这表明Mdivi-1对AD样炎性混合物诱导的角质形成细胞的作用与Drp1沉默相同。4.在DNCB诱导的小鼠AD模型中,应用Drp1选择性抑制剂Mdivi-1可以改善AD样皮炎症状,缓解瘙痒症状,降低皮炎评分,降低血清Ig E水平,减少IL-4、IL-5、IL-13的产生,改善病变组织表皮增厚、肥大细胞和嗜酸性粒细胞浸润。5.在DNCB诱导的小鼠AD模型皮损中,Drp1的表达增高,应用Drp1选择性抑制剂Mdivi-1可以使小鼠皮损中细胞焦亡相关指标NLRP3、ASC、活化caspase-1、GSDMD-NT、IL-1β和IL-18表达降低;LDH水平降低;p65和IκBα磷酸化水平降低,P65入核减少;线粒体融合相关蛋白Mfn1,Mfn2和Opa1表达升高。结论:在细胞和动物AD模型中,抑制Drp1可以调控线粒体分裂融合平衡,抑制NF-κB通路进而抑制NLRP3炎性小体激活,减少细胞焦亡,最终改善AD;Drp1抑制剂Mdivi-1可能会作为治疗AD药物的一种新选择。