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目的:EGFR vⅢ突变是胶质瘤中最常见的恶性事件,参与胶质瘤多种恶性进展。我们提取U87-vⅢ和U87细胞核蛋白做质谱分析发现:当EGFR vⅢ突变激活时,组蛋白H2AZK4/7AC表达减少。组蛋白乙酰化通常与基因转录相关,我们猜想EGFR vⅢ通过下调H2AZK4/7AC影响抑癌基因转录,进而加快胶质瘤恶性进展。我们通过构建EGFR vⅢ持续过表达的胶质瘤细胞并联合小分子抑制剂的使用探索EGFR vⅢ下调H2AZK4/7AC的机制,以及H2AZK4/7AC参与胶质瘤细胞周期调控的可能机制。并从表观遗传失调的角度入手,探索EGFR vⅢ突变的胶质瘤潜在的药物治疗靶点和HDAC抑制剂FK228的治疗作用。力争为EGFR vⅢ突变的胶质瘤提供新的有前景的治疗方案。方法:1、用慢病毒转染U87,U251,N9细胞得到稳定表达EGFR vⅢ的胶质瘤细胞系,利用质谱分析EGFR vⅢ突变后H2AZK4/7AC表达变化。在体外用Western blotting和免疫荧光验证EGFR vⅢ突变对H2AZK4/7AC表达的影响。用广谱的HDAC抑制剂TSA处理U87-vⅢ,U251-vⅢ,N9-vⅢ细胞后观察H2AZK4/7AC表达变化。IP实验探究HDAC1/2与H2AZ之间的相互作用,实施免疫荧光实验观察HDAC2和H2AZ是否存在共定位。然后用针对HDAC1和HDAC2的Si RNA处理U87-vⅢ,U251-vⅢ,N9-vⅢ细胞后观察H2AZK4/7AC表达变化。选取PI3K/AKT通路抑制剂LY294002处理细胞,阻滞EGFR vⅢ突变后引起的PI3K/AKT持续激活,观察HDAC2,H2AZK4/7AC,H3K27AC,H3K27me3的表达变化。另外,因为HDAC1/2通常形成复合物发挥作用,用Si RNA同时敲除HDAC1/2后观察下游H2AZK4/7AC,H3K27AC,H3K27me3,H3K4me3变化。2、U87-vⅢ和U87细胞的总蛋白质谱结果中选取106个当EGFR vⅢ突变后表达下调的基因,带入TCGA、CGGA数据库分析预测其与EGFR的相关性,与预后的相关性,与胶质瘤级别的相关性,与组织分型的相关性,筛选出候选基因。验证EGFR vⅢ是否可以通过PI3K/AKT-HDAC1/2轴,表观遗传学的方式下调USP11的转录和翻译,检测P-AKT,HDAC1,HDAC2,H3K27AC,H2AZK4/7AC,USP11表达变化,分别运用LY294002和针对HDAC1和HDAC2的Si RNA处理细胞后观察USP11的回复情况,Chip-q PCR验证EGFR vⅢ是否能通过减少USP11启动子区域的H3K27AC和H2AZK4/7AC的富集从而下调USP11的转录和翻译。3、探究FK228（HDAC1/2阻滞剂）对EGFR vⅢ突变的胶质母细胞瘤细胞周期的影响,FK228预处理细胞后用流式细胞术检测细胞周期的变化,WB检测Cyclin D1,CDK4,CDK6,P21表达变化。构建U87-vⅢ和U87的颅内模型,探究FK228对肿瘤生长的影响,和下游Cyclin D1,CDK4,CDK6,P21,USP11的体内表达变化情况。结果:1、EGFR vⅢ突变后H2AZK4/7AC表达下调。EGF刺激U87细胞同样能引起H2AZK4/7AC下调。TSA处理细胞后H2AZK4/7AC表达明显上调,提示HDACs可能参与H2AZK4/7AC表达调控,IP实验证实H2AZ分别和HDAC1和HDAC2存在相互作用,敲除HDAC2后H2AZK4/7AC表达升高,共聚焦显示HDAC2和H2AZ存在细胞核共定位。EGFR vⅢ突变后HDAC1/2转录和翻译水平上升,EGFR vⅢ突变后激活PI3K/AKT通路,LY294002处理后HDAC2表达减少,同时H2AZK4/7AC,H3K27AC表达增加。H3K27me3,H3K4me3表达未见明显变化。同时敲除HDAC1/2后,H2AZK4/7AC,H3K27AC表达增加。H3K27me3表达未见明显变化。2、生物信息学分析显示USP11,SELK,HIP1R,CYFIP2,ALAD与EGFR表达呈现负相关,与胶质瘤级别呈负相关,高表达预后更好,与胶质瘤组织分型有关。EGFR vⅢ通过PI3K/AKT-HDAC1/2轴,表观遗传学的方式下调USP11的转录和翻译。3、体外实验证明FK228能诱导EGFR vⅢ突变的胶质母瘤细胞G1/S期阻滞。颅内模型证实FK228能减慢携带EGFR vⅢ突变的胶质母细胞瘤生长通过阻滞G1/S期转变。在体内实验中,EGFR vⅢ突变后P-AKT,HDAC1,HDAC2表达上调H3K27AC,H2AZK4/7AC,USP11表达下调。FK228处理能部分逆转EGFR vⅢ突变引起的USP11下调。结论:1、EGFR vⅢ突变能通过PI3K/AKT-HDAC2轴下调H2AZK4/7AC的表达。2、HDAC2,而不是HDAC1,能特异性结合并且调控H2AZK4/7AC的去乙酰化修饰。3、EGFR vⅢ通过PI3K/AKT-HDAC1/2轴,表观遗传学的方式下调USP11的转录和翻译。4、EGFR vⅢ通过下调USP11启动子区域的H3K27AC和H2AZK4/7AC的结合量从而下调USP11的表达,FK228处理能部分逆转EGFR vⅢ突变引起的USP11下调。5、在体内和体外实验中,FK228可以在EGFR vⅢ突变的胶质母细胞瘤诱导G1/S期阻滞从而发挥治疗效果。