研究背景：　　 胶质瘤是原发性脑肿瘤中发病率最高且预后较差的肿瘤,流行病学调查显示,胶质瘤约占原发性脑肿瘤的一半左右,且近年来还有上升的趋势。在过去二十年里,化疗药物治疗胶质瘤经历了很多挑战;伴随替莫唑胺(temozolomide,TMZ)的发现,化疗药物治疗胶质瘤取得了实质性进展。替莫唑胺是一种新型口服烷化剂药物,血脑屏障透过率高,能够延长胶质母细胞瘤病人的生存时间。除此之外,由于它的低毒性,替莫唑胺是长期治疗胶质母细胞瘤药物的首选。神经外科医生在胶质瘤治疗上已经做了很多临床和基础工作,但胶质母细胞瘤患者的预后仍然非常差,中位生存时间只有14.6个月[4],5年生存率仍然小于50%。烷化剂治疗后肿瘤复发的机制可能与DNA修复基因有关,如MGMT,MSH2和MSH6。　　 胶质瘤的主要组织学特征是具有不同阶段的分化细胞群和形态的异质性。这种肿瘤的异质性可能会造成治疗上的挑战,因为不同肿瘤组织内的细胞群可能对治疗产生不同的反应。克服这些问题的策略之一是确定和描述不同的亚群,找出特定疾病的共同特征,如肿瘤的发生、肿瘤复发或两者兼而有之。在定义上,干细胞和肿瘤细胞有重叠之处;特别是在不断增殖方面,基因表达的异常与干细胞行为在肿瘤生物学发挥了作用。因此人们推测,在肿瘤细胞中存在干细胞样肿瘤细胞,它在肿瘤细胞中所占比例相对较小,具有抗肿瘤治疗的可能性。2001年Reya等用实验证明,白血病和多种实体瘤只有为数不多的一类特殊细胞,具有无限增殖、自我更新和多向分化潜能;通过比较干细胞和肿瘤细胞,他们发现二者具有相似的生物学特性,提出肿瘤干细胞(Cancerstemcells,CSCs)学说。肿瘤干细胞学说可以很好的解释肿瘤发生与肿瘤耐药。Singh等利用神经球悬浮生长法从脑肿瘤组织中分离出一小群具有自我更新、不断增殖和多向分化能力的细胞,提出胶质瘤干细胞(gliomastemcells,GSCs)学说。人们推测胶质瘤细胞化疗耐药可能与胶质瘤干细胞有关,而且胶质瘤干细胞的化疗耐药比我们想象的要复杂。Gaspar等发现SonicHedgehog和Notch信号通路与胶质瘤干细胞对替莫唑胺的化疗耐药有关。　　 胶质瘤预后较差的原因可能是由于其具有侵袭性,它可以通过白质纤维迁移到周围脑组织从而逃避手术治疗。胶质瘤细胞的迁移,是一个复杂的动态过程,涉及到多种生物学特性。尤其是胶质瘤干细胞,其侵袭性要比分化的胶质瘤细胞高。很多研究发现转化生长因子(transforminggrowthfactor,TGF)-β2可以促进胶质瘤的侵袭。TGF-β2,作为一个主要调节人脑胶质瘤免疫抑制的因子,与胶质瘤的预后及进展紧密相。TGF-β2可以通过提高基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)和αvandβ3整联蛋白(integrin)的表达影响细胞侵袭功能。　　 因此我们想深入的研究替莫唑胺对于胶质瘤干细胞的作用,尤其是对胶质瘤干细胞侵袭的影响,以及是否通过TGF-β2影响胶质瘤干细胞侵袭。从而能提高替莫唑胺对胶质瘤的治疗效果,改变传统的胶质瘤治疗方案,为胶质瘤患者延长生命、甚至长期存活打下坚实的基础。　　 目的：　　 1、从原代培养的胶质瘤细胞(primaryculturedgliomacells,PCGCs)获得悬浮培养的肿瘤细胞球,并进行鉴定证明是胶质瘤干细胞。　　 2、研究胶质瘤干细胞的侵袭能力。　　 3、替莫哗胺是否影响胶质瘤干细胞侵袭性。　　 4、观察替莫唑胺是否通过TGF-β2影响胶质瘤干细胞侵袭能力。　　 方法：　　 第一部分:获得的胶质瘤细胞标本通过胰蛋白酶消化法进行原代培养,得到PCGCs:PCGCs加入含有生长因子(EGF,bFGF,B27)DEME/F12无血清培养基培养,获得悬浮生长的肿瘤球细胞。通过免疫荧光染色及分化实验,证明悬浮生长的肿瘤细胞球为GSCs。　　 第二部分:Transwell体外侵袭实验比较GSCs和PCGCs的侵袭能力:TMZ是否抑制GSCs的侵袭能力。　　 第三部分:实时定量逆转录.聚合酶链反应(realtimeReverseTranscription-PolymeraseChainReaction,realtimeRT-PCR)检测TMZ对GSCs中TGF-β2mRNA表达水平影响,酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测TMZ对GSCs作用后上清液中TGF-β2蛋白表达水平影响。分别添加外源性TGF-β2和TGF-β2抗体,Transwell体外侵袭实验证实TMZ通过TGF-β2影响GSCs侵袭。　　 第四部分:统计学分析:所有的定量数据用平均值±标准差表示,统计学分析使用SPSS10.0软件进行t检验,以P＜0.05认为有统计学意义。　　 结果：　　 一、胶质瘤干细胞培养与鉴定　　 获得的胶质瘤标本通过胰蛋白酶消化法得到贴壁生长的PCGCs。PCGCs在含有EGF、bFGF、B27的DMEM/F12培养基中培养5-7天后可以观察到悬浮生长的肿瘤细胞球:肿瘤细胞球生长稳定,可以传代。免疫荧光染色实验证实肿瘤细胞球表达CD133,说明培养的肿瘤细胞球为GSCs。GSCs在含10%胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)DMEM/F12培养基中培养7天后,肿瘤细胞球贴壁生长,肿瘤细胞形态多样,大小不一,以梭形为主,有的细胞突触很长,原有的形态消失。免疫荧光检测发现这些细胞表达胶质瘤干细胞分化的标记物:胶质细胞标记物(胶质纤维酸性蛋白,glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)和神经元标记物(β-Ⅲ-tubulin)。　　 二、TMZ可以降低GSCs侵袭能力　　 对4个来自不同患者的胶质瘤标本培养出的GSCs和PCGCs进行了Transwell体外侵袭力比较,我们发现GSCs的侵袭力要强于PCGCs。应用相同的方法,我们证实TMZ可以抑制GSCs的侵袭能力。为了说明这一现象不是由于TMZ对GSCs增殖抑制作用引起的,我们进行了MTT实验并证实在24小时内TMZ没有抑制GSCs增殖。　　 三、TMZ通过降低TGF-β2表达来抑制GSCs侵袭性　　 1、TMZ可以降低GSCs中TGF-β2mRNA表达水平。　　 2、ELISA结果说明TMZ可以降低GSCs上清液中TGF-β2蛋白表达水平。　　 3、TGF-β2可以增加GSCs的侵袭力。　　 4、TMZ对GSCs的侵袭抑制与TGF-β2表达含量减少有关。　　 结论：　　 1、PCGCs加入含有EGF、bFGF、B27的DEME/F12无血清培养基可以得到胶质瘤干细胞。　　 2、GSCs的侵袭力要强于PCGCs。　　 3、TGF-β2可以增加GSCs的侵袭力。　　 4、TMZ不仅可以在mRNA水平上降低GSCs中TGF-β2表达,还可在降低GSCs上清液中TGF-β2表达。　　 5、TMZ通过降低TGF-β2表达来抑制GSCs侵袭。