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目的:通过探讨T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)分子的β、α双链恒定区结构域分别被免疫球蛋白IgG的重链C1区和轻链恒定区结构域替换后,其激活下游信号分子、活化T细胞能力的变化情况来确定改造后的TCR是否具有相应的生物学功能,用以证明这种恒定区结构域改造策略不仅可以使TCR基因修饰的T细胞(TCR-T)内所产生的外源TCR分子与内源TCR分子错配情况减少,而且恒定区结构域改造的TCR分子仍然有相应的生物学功能,为改善TCR基因修饰的T细胞过继性免疫治疗提供借鉴。方法:一、穿梭质粒载体pDC315-rβ-IRES-rα的构建本实验室在前期工作中把经优势取用得到的TCR Vα12.2/Vβ7.1分子的双链恒定区结构域分别替换为IgG的轻链恒定区结构域和重链C1区,保留了两条链的抗原识别区、跨膜区和胞内区这样就形成了一种三明治形式的嵌合型TCR分子(chim-TCR),并利用IRES将其进行连接实现双链胞内共表达,两条链分别被黄绿色荧光蛋白和青色荧光蛋白标记后克隆到pDC315载体上(pDC315-rβYFP-IRES-rαCFP),经过FRET分析表明其可以抑制杂合TCR分子的产生。为研究这种嵌合型TCR分子是否和野生型TCR分子一样具有相应的生物学功能,首先需要去除两种荧光蛋白,以防止其对rβ、rα功能的影响。我们以载体pDC315-rβYFP-IRES-rαCFP为基础,扩增嵌合型TCR分子双链rβ及IRES-rα,通过EcoRI、Nhe I的酶切、连接反应构建过渡载体pDC315-rβ;然后对pDC315-rβ及IRES-rα进行NheI、Sal I双酶切,并连接为重组嵌合型腺病毒包装用穿梭质粒载体pDC315-rβ-IRES-rα,以进行后续嵌合型TCR分子生物学功能方面的研究。二、重组嵌合型腺病毒Ad5/F35-rβ-IRES-rα的构建利用Lipofectamine 2000将Ad5/F35腺病毒骨架质粒pBHGIoxdeE1Cre与穿梭质粒pDC315-rβ-IRES-rα共转染HEK-293细胞,以包装携带嵌合型TCR基因的重组腺病毒载体;将获得的病毒转染7402细胞,提取总RNA,通过RT-PCR法获得c-DNA,以c-DNA为模板进行目的基因的扩增来检测重组嵌合型腺病毒是否构建成功;将鉴定正确的重组嵌合型腺病毒大量扩增后经tcid50法检测病毒滴度;按照moi=100进行病毒转染淋巴细胞,通过流式细胞仪检测目的基因在淋巴细胞的表达情况。三、嵌合型tcr分子生物学功能的鉴定通过免疫印迹法对嵌合型tcr分子转导刺激信号、活化t细胞的能力进行检测,所检测的信号分子包括:pkc、erk、nfat的磷酸化与去磷酸化情况;通过荧光定量pcr对il-2、ifn-γ的表达水平进行分析;通过elisa检测细胞因子il-2和ifn-γ的分泌水平。结果:一、以本实验室前期构建的含有嵌合型tcr分子的重组质粒pdc315-rβyfp-ires-rαcfp为基础,成功构建了含嵌合型tcr基因的重组腺病毒穿梭质粒载体pdc315-rβ-ires-rα。二、将穿梭质粒pdc315-rβ-ires-rα和ad5/f35型腺病毒骨架质粒共转染hek-293细胞,成功包装出重组嵌合型tcr腺病毒ad5/f35-rβ-ires-rα;利用rt-pcr在重组嵌合型tcr腺病毒中检测出目的基因rβ-ires-rα;利用重组嵌合型tcr腺病毒感染淋巴细胞后,通过流式细胞术检测到嵌合型tcr分子的表达率为10%左右;tcid50法测得扩增后的重组嵌合型tcr腺病毒滴度达到1.3×108iu/ml。三、重组嵌合型腺病毒转染淋巴细胞并行特异抗体刺激,经荧光定量pcr、酶联免疫吸附法均检测到细胞因子ifn-γ的变化较之于未转染淋巴细胞组有显著性的升高,而il-2只有48小时的分泌水平于两组间具有显著性差异;蛋白免疫印迹检测到在经嵌合型tcr基因转染并接受特异抗体刺激的t淋巴细胞中,信号分子pkc、erk的磷酸化与去磷酸化情况发生明显的变化,而nfat的去磷酸化变化不明显。结论:所构建的嵌合型tcr分子以腺病毒为载体能成功转入淋巴细胞内,并得到有效表达;其激活淋巴细胞、传递活化信号至下游信号分子的能力得到有效保留;表明采用igg的轻链恒定区与重链c1区分别替换tcr的α、β链恒定区结构域的策略是可行的,从而为改善tcr基因修饰的t细胞过继性免疫治疗提供了借鉴。