论文部分内容阅读
水产品腐败主要是由微生物引起的,而大黄鱼肉质中水分含量高、可溶性蛋白含量高、组织结构松散,更容易滋生微生物引起腐败。在低温贮藏条件下水产品中主要的特定腐败菌为假单胞菌属(Pseudomonas spp.)和希瓦氏菌属(Shewanella spp.)。水产品的腐败过程主要是由细菌群体感应系统调控的,其中在革兰氏阴性菌中典型的群体感应信号分子是酰基高丝氨酸内酯类(AHLs),已在大多数革兰氏阴性菌中检测到,但是在波罗的海希瓦氏菌(Shewanella baltica)中还没有相关报道,群体感应信号分子调控水产品腐败的机制也鲜有报道。鉴于此,本研究采用一种高效、高灵敏度的液质联用(UPLC-QqQ-MS/MS)技术检测S.baltica上清液中AHLs信号分子,研究了不同S.baltica菌株致腐能力的差异以及外源AHLs对S.baltica致腐能力的影响,并初步研究了群体感应信号分子产生的基因调控及其诱导腐败相关基因表达的机制。主要研究结果如下:1.建立UPLC-QqQ-MS/MS检测体系,快速高效地在5.6min内检测11种AHLs(r2>0.99)。对四种菌株上清液中AHLs提取条件进行比较,采用乙酸乙酯(0.1%甲酸酸化)作为萃取剂能够检测到响应的信号(1ng/ml),且回收率大于88.4%。首次在S.baltica菌株检测到了 AHLs信号分子,12/18株被检测到,除了 C7-HSL、C14-HSL其它9种的信号分子均在上清液中被检测到,其中C10-HSL信号分子是大多数菌株产生的,也是产生数量较多的信号分子。不同的S.baltica 菌株产生AHLs信号分子的种类、数量以及产生的时间点不同。2.外源AHLs信号分子对S.baltica S.100菌株生长曲线和细菌数量没有显著影响,但是对S.balica生物被膜的形成、TVB-N的生成、蛋白酶水解活性有一定的促进作用。结合RCBD数据模型分析得出,C10-HSL信号分子显著提高了S.baltica100菌株生物被膜的聚集吸附能力和密集程度,促进了生物被膜的成熟与稳定;羰基官能团对于信号分子的添加增强生物被膜的形成能力并没有起到关键性的作用;不同的AHLs对调控S.baltica 100菌株生物被膜形成发挥作用的时间段不同。外源AHLs信号分子的添加对强和弱致腐能力菌株产TVB-N的影响影响较显著;4℃放置1d的条件下,添加C8-HSL、3-oxo-C8-HSL、C10-HSL、3-oxo-C10-HSL 诱导组的 TVB-N 显著提高,4d 之后信号分子的添加组与对照组的差别很小。S.baltica 100菌株在添加11种信号分子诱导后,C8-HSL、3-oxo-C12-HSL添加组的透明圈明显变大,显著增强蛋白酶水解活性;C7-HSL、C14-HSL抑制了蛋白酶水解活性。外源AHLs对菌株的致腐能力的影响与该菌株检测到的信号分子的种类和数量并没有发现直接的相关联系。3.所有待测S.baltica菌株上清液都能诱导哈维氏弧菌BB170产生荧光,且都是在指数后期达到最大值,在稳定期荧光值急剧下降。AI-2的转录水平和pfs的转录水平有较高的相关性,而与luxS转录水平不完全一致,AI-2浓度的变化部份地归因于pfs表达水平的改变。S.baltica菌株分泌AHILs的含量与luxR转录水平的最大值均出现在指数中期至指数后期的培养过程中,且二者的变化趋势均为先增后减,并且发现酰基侧链较短的AHL信号分子上调luxR表达水平的影响较显著。S.baltica.菌株致腐能力的强弱与腐败相关基因(torT、tor A)的表达水平呈正相关,同一种AHLs信号分子的添加对腐败指标TVB-N的产生和腐败相关基因(torT、torA)的表达水平影响显著相关。