研究背景干细胞是指一类具有自我增殖能力和分化潜能的细胞，在特定的条件下可以分化为不同的功能细胞，甚至形成多种组织和器官。因此，干细胞的研究已成为生命科学的一个重要领域。业已证实，成年个体骨髓内存在具有多向分化特性的干细胞，在体内和体外不同的微环境下，这些多潜能干细胞可以分化成三个胚层来源的细胞和组织结构如皮肤和神经细胞，肝细胞和胰腺细胞、骨细胞和软骨细胞、脂肪细胞和肌细胞及内皮细胞等，显示了成体骨髓多功能干细胞极高的可塑性。这对于各种先天性疾病、老年性疾病和各种原因所致的组织缺损具有重要的应用前景。目前备受关注的干细胞主要有胚胎干细胞，神经干细胞，造血干细胞和骨髓间充质干细胞等。胚胎干细胞由于其无与伦比的增殖能力和分化潜能而成为干细胞研究较为理想的模型，但由于存在论理学的问题胚胎干细胞的研究仍然受到限制。相对间充质干细胞的研究却日益显示了其强大的生命力，这主要表现在以下几个方面：(1)首先间充质干细胞从增殖能力和分化潜能上具备干细胞最基本的特点，其分化潜能不仅仅局限于中胚层组织，而且在特定的条件下可以向内胚层和外胚层的组织细胞分化；(2)成年个体一生中均具备间充质干细胞库，这也可能是成年个体组织更新和组织修复的必备前提，而且由于成体干细胞在定向分化进行组织修复中不存在主要组织相容性复合物的限制的特性，使得成体干细胞在治疗上的前景更加广阔；(3)骨髓间充质干细胞的取材和分离非常容易，培养条件相对成熟，已经可以在体外大量扩增。急性肝衰竭仍是一种死亡率较高的疾病，肝移植是治疗这种疾病的一种有效方法。但肝移植存在许多问题，如：供体缺乏、手术创伤大、排异、费用昂贵等。所以，迫切需要其他可以选择的治疗急性肝衰竭的方法。肝细胞移植可作为肝脏移植的一种替代方法，但同样存在着供体来源受限问题，同时肝细胞的获取具有很大的创伤性。干细胞的研究为解决这个问题提供了新的希望。骨髓间充质干细胞具有极强的多向分化潜能，国内外许多研究已证明其在体内、体外可分化为肝细胞。同时骨髓间充质干细胞的来源充足，易于获得，作为组织干细胞的一种，增殖能力强，体外能大量扩增，能满足细胞移植要输入大量功能细胞的要求。病人可使用自体骨髓移植，完全克服免疫排斥，从根本上解决器官移植面临的免疫排斥问题。Jang YY等发现，当造血干细胞与受损的肝细胞共同培养时，造血干细胞在7个小时内就可转化为肝细胞。Makowka L等报道腹腔内移植骨髓干细胞可提高D—半乳糖胺诱导的急性肝衰竭大鼠的生存率。Liu ZC等将微囊化骨髓干细胞移植于90％肝切除诱导的急性肝衰竭大鼠腹腔内，发现微囊内的骨髓干细胞可在腹腔内转化为肝细胞样细胞，并提高急性肝衰竭大鼠的生存率。这些研究说明，骨髓干细胞可用来治疗急性肝衰竭。但目前尚未见肝脏内移植骨髓干细胞治疗急性肝衰竭的报道。骨髓干细胞包含造血干细胞及骨髓间充质干细胞，单独骨髓间充质干细胞移植是否亦有助于治疗急性肝衰竭亦未见相关报道。因此我们设计此课题观察骨髓间充质干细胞门静脉移植是否能够治疗大鼠急性肝衰竭。目的(1)探索从大鼠骨髓中分离、培养骨髓间充质干细胞的方法，建立稳定的大鼠骨髓间充质干细胞系，为后续的干细胞研究提供稳定的细胞模型(2)建立大鼠肝切除急性肝衰竭模型，将体外培养的骨髓间充质干细胞大鼠肝内移植，探讨骨髓间充质干细胞移植是否有助于急性肝衰竭的治疗及可能的治疗机制。方法(1)利用Percoll密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离有核细胞，在15％胎牛血清，表皮生长因子，白细胞抑制因子和血小板衍生生长因子的作用下用DMEM／F-12培养基进行培养，获得大鼠骨髓间充质干细胞。绘制细胞生长曲线，以Patterson公式计算细胞在对数生长期的倍增时间。用TRAP—银染法检测该细胞系的端粒酶活性，流式细胞术测定该细胞系在反复传代后细胞的表型的稳定状况。(2)以BrdU标记骨髓间充质干细胞。建立90％肝切除诱导的急性肝衰竭模型，F-344大鼠随机分为二组，A组(实验组)：90％肝切除后经门静脉移植0.5ml骨髓间充质干细胞悬液(含有1×10~6个细胞)；B组(对照组)：90％肝切除后经门静脉移植0.5ml生理盐水。观察术后二组大鼠的一般情况、血清生化指标及生存率，并取实验组肝组织制备切片，通过免疫组化、免疫荧光双标记技术观察受体大鼠肝组织内移植细胞情况。结果(1)刚刚开始贴壁生长的骨髓间充质干细胞呈规整的燕麦形，形态规整。克隆形成后对数生长期大鼠骨髓间充质干细胞呈梭形或长多边形，形态不完全均一，但细胞排列整齐，边界清晰，在培养瓶中分布及生长均匀。绘制细胞生长曲线，Patterson公式计算骨髓间充质干细胞的倍增时间为18hr。TRAP—银染法测定骨髓间充质干细胞端粒酶活性，显示大鼠骨髓间充质干细胞的端粒酶为阳性，表达强度与肿瘤细胞(SKOV3)一致。流式细胞术测定骨髓间充质干细胞的DNA含量和细胞周期，分析结果并与肿瘤细胞SKOV3进行比较。可见骨髓间充质干细胞100％为二倍体，S期细胞数量较多(34.72％)，而肿瘤细胞有较高的异倍体率，二倍体细胞仅为41.97％，而且S期细胞显著减少(12.1％／34.7％)。流式细胞术细胞表型的鉴定分析显示骨髓间充质干细胞表达CD44、CD90，而CD34、CD45、MHCⅠ、MHCⅡ为阴性。(2)BrdU标记的骨髓间充质干细胞细胞染色后可见细胞核内有棕褐色阳性反应物。台盼蓝染色测定BrdU标记后细胞活率，可见标记后细胞活率95％±0.6％。90％肝切除后，大鼠于术后2-4小时内苏醒，然后逐渐进入肝功能衰竭状态，表现为拒食，活动明显减少，毛蓬松。精神萎靡、嗜睡或昏睡，对外界刺激反应迟钝，尿失禁，尿色深黄。大部分大鼠于术后3日内死亡，7天存活率仅为20％。术后大鼠血清丙氨酸转氨酶及天冬氨酸转氨酶水平迅速升高，并于术后第一天达到峰值，之后逐渐下降，术后1、2、3、5天血清丙氨酸转氨酶及天冬氨酸转氨酶值明显高于术前(P＜0.05)。术后第7天时丙氨酸转氨酶及天冬氨酸转氨酶值仍高于术前，但无统计学差异。ALB水平于术后开始下降，第2天时达到最低水平，于第3天开始上升，术后1、2、3、5天血清白蛋白值明显低于术前值(P＜0.05)。术后第7天时白蛋白值虽仍高于术前，但统计学上无显著性差异。肝衰竭大鼠经门静脉移植骨髓间充质干细胞后发现：实验组大鼠术后7天存活率为70％，对照组大鼠术后7天存活率为20％，实验组大鼠存活率明显高于对照组(P＜0.05)。术后两组大鼠丙氨酸转氨酶及天冬氨酸转氨酶水平均升高，白蛋白水平降低。术后3、5天时实验组各项指标较对照组有所改善，其中丙氨酸转氨酶及天冬氨酸转氨酶改善明显，两组数据比较差异有显著性(P＜0.05)，白蛋白在数值上虽有改变，但两组数据在统计学上无显著性差异(P＞0.05)。术后第7天时两组各项生化指标均接近正常范围，两组间数据比较无显著性差异(P＞0.05)。免疫组织化学染色观察结果显示BrdU标记的骨髓间充质干细胞移植后可在肝组织中出现，多分布在汇管区周围，细胞核染成棕褐色，细胞表现肝细胞形态。免疫荧光双染色，大鼠肝组织切片中见BrdU标记细胞为绿色荧光，白蛋白为红色荧光，绿色荧光与红色荧光叠合后呈黄色。黄色细胞来源于BrdU标记并有白蛋白表达的细胞。结论(1)利用Percoll密度梯度离心法分离F-344大鼠骨髓有核细胞，在15％FCS、EGF、LIF和PDGF的作用下，用DMEM-LG／F-12培养基进行培养，可获得稳定生长的大鼠MSCs。培养的骨髓间充质干细胞系性状稳定，表型稳定均一，是理想的大鼠骨髓间充质干细胞系，可用于进一步的组织工程、细胞和分子生物学研究。(2)骨髓间充质干细胞经门静脉移植于急性肝衰竭大鼠体内，改善了受损肝脏的功能，显著提高了急性肝衰竭大鼠的生存率；骨髓间充质干细胞可在急性肝衰竭大鼠肝脏中转化为有功能的肝细胞；经门静脉移植骨髓间充质干细胞治疗急性肝功能衰竭是可行