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干扰素γ(IFNγ)信号通路在免疫反应、炎性反应、抗肿瘤免疫等过程中发挥至关重要的作用,其功能状态是决定肿瘤免疫治疗成败的关键。IFN-γ发挥作用主要是通过结合膜表面受体IFN-γR并激活其下游的信号分子,调节相关基因的转录和表达。IFN-γR由两种亚单位组成:IFNγR1(IFNGR1)和IFNγR2(IFNGR2)。IFNGR1在细胞中表达相对过剩,IFNGR2的表达受到机体严格的调控。IFNGR2的表达水平直接决定了IFNγ信号通路反应性,因此调控IFNGR2的表达是提高免疫治疗效果的潜在突破口,阐明IFNGR2的调控机制有助于深入理解IFNγ信号通路有关的免疫反应和疾病发生过程,具有潜在的临床意义。为了发现调控IFNGR2表达和IFNγ信号通路的基因、小分子化合物等,寻找研究其调控方式及其分子机制的新思路和新策略,本文采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在IFNGR2基因末端原位敲入融合表达的绿色荧光蛋白(EGFP),建立IFNGR2报告细胞系,通过绿色荧光强度表征活细胞中内源IFNGR2的表达情况,实现对IFNGR2受调控程度的快速、通量化监测。我们采取了两种策略来实现EGFP的敲入,分别为CRISPR介导的微同源末端连接技术(microhomology-mediated end-joining,MMEJ)和CRISPR介导的同源重组技术(homologous recombination,HR)。两种敲入策略均通过CRISPR-Cas9系统造成IFNGR2基因最后一个外显子末端的DNA双链断裂,同时引入供体载体中含有EGFP编码序列以及与DNA断裂位置的同源序列,运用细胞内的多种DNA修复机制实现基因敲入。两种方法的主要区别在于,MMEJ利用细胞内的微同源重组修复机制来完成基因编辑,所需同源序列长度为20bp左右;HR利用细胞内同源重组修复机制,需要的同源序列较长,为200bp左右。微同源末端连接不受细胞周期的限制,敲入效率更高;而同源重组因为有更长的同源序列,可以更为灵活地选择CRISPR-Cas9靶位,两种策略各具优势,具有一定互补性。在构建knock-in细胞系时,我们分别选取了小鼠黑色素瘤细胞系B16和小鼠细胞前列腺癌细胞系My C-Ca P,以及人源结肠癌细胞系HCT116。我们将Cas9载体(携带靶向IFNGR2基因sg RNA)和供体载体(携带EGFP编码序列及敲入位点同源序列)同时转入细胞系,利用抗生素抵抗基因筛选获得候选细胞克隆。通过提取基因组DNA和PCR鉴定,明确EGFP编码序列正确插入;对候选克隆进行EGFP表达筛选,选取EGFP表达水平相对较高的克隆;最后先验证这些克隆具有正常的IFNγ反应性,确定稳定细胞系构建成功;在此基础上,进一步检测IFNGR2调控因子对细胞系IFNGR2和EGFP表达水平的调控作用。我们发现肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)和奥沙利铂(Oxaliplatin)可以明显促进敲入细胞系中Ifngr2和EGFP表达水平。TNF-α是一类十分重要的细胞因子,调控各种免疫过程并可诱导肿瘤细胞凋亡。有研究提示TNF-α可以通过NF-κB信号通路调控IFNGR2表达。Oxaliplatin作为一种抗肿瘤药物,广泛地使用在多种癌症的治疗方案中,最新研究表明其具有明显促进抗肿瘤免疫治疗的作用。我们的结果提示Oxaliplatin具有促抗肿瘤免疫的作用,是通过调控肿瘤细胞IFNGR2表达进而提高肿瘤细胞对IFNγ的敏感性实现的。本研究基于CRISPR/Cas9基因编辑技术,在My C-Ca P前列腺癌细胞系和小鼠B16黑色素瘤细胞系和人结肠癌细胞系HCT116中Ifngr2末端敲入EGFP基因。基因组水平确认成功将EGFP基因敲入B16细胞系和My C-Ca P细胞系Ifngr2基因末端,其中B16细胞中可检测到绿色荧光的表达。进一步的,我们在构建的B16 Ifngr2-EGFP细胞系中对细胞因子和抗肿瘤药物调控IFNGR2表达进行了初步研究。结果表明,B16 Ifngr2-EGFP细胞系中,TNFα和Oxaliplatin可以上调IFNGR2的表达,绿色荧光蛋白的表达变化能够反映IFNGR2的表达情况。本文建立的细胞系,为深入研究IFNGR2表达、IFNγ信号通路调控和免疫调控活性药物筛选等研究提供了有力的技术支撑。