论文部分内容阅读
目的胃癌发病率及死亡率每年居高不下,造成严重的社会负担[1,2]。胃癌的病因已有较明确的结论,但其详细的发病机制尚未完全阐明,近年来基因组不稳定性作为胃癌的一种潜在发病机制越来越受到关注[3,4],DNA损伤修复反应受损是基因组不稳定性产生的重要原因[5]。在胃炎、肠化、不典型增生乃至发展到胃癌的过程中,DNA突变程度与胃上皮损伤级联反应相关[6,7],因而胃上皮细胞的DNA损伤及修复反应是胃癌发生的一种重要的发病机制[5,8,9]。DNA损伤后会激活一种叫DNA损伤应答(DDR)的反应,以修复受损的基因组,保证基因组完整性以及阻止细胞恶化[10]。同源重组修复(HR)是一种高保真修复的DDR,以同源姐妹染色单体作为模板精确修复DNA损伤[11],当细胞内HR受抑制时,细胞会倾向于选择易出错的非同源末端连接(NHEJ)来完成修复[12],从而引起细胞内出现较多的异常DNA,导致基因组不稳定性增加。环状GMP-AMP合酶(cGAS)是一种位于细胞质内的DNA感受器,通过感知细胞质中的DNA来激活固有免疫[13],近年来发现基因组不稳定性产物和一些肿瘤来源的DNA,如死亡肿瘤细胞的DNA,微核,细胞质染色质片段和游离端粒DNA,可以激活cGAS-STING通路并诱导细胞衰老[14,15],炎症和抗肿瘤免疫[16-18]、自噬[19],DNA修复反应[20]等,因而对肿瘤发生产生不同的效应。最新研究表明,在Lewis肺癌中,cGAS通过抑制肺癌细胞内HR修复促进肿瘤发生[20]。鉴于cGAS在多种肿瘤进展中的不同调节作用[21,22],且在胃癌中尚无有关cGAS的研究,因此本研究拟通过探索cGAS在胃癌组织中的表达,及使用RNA干扰技术来研究cGAS表达对胃癌细胞AGS和MKN45功能的影响以判断cGAS在胃癌发生进程中的作用,并通过检测沉默cGAS表达后胃癌细胞内HR关键蛋白的变化来探索可能的机制。方法1.在 TCGA(Human Cancer Genome Atlas)数据库中分析 cGAS 在 384 例胃癌患者和37例正常人胃组织中的表达差异;通过免疫组化实验验证41例胃癌患者癌组织及邻近癌旁组织的表达,并分析cGAS表达与胃癌患者临床病理特征之间的关联性。实时荧光定量qPCR实验分析“正常”胃上皮细胞系GES-1和3株常见的胃癌细胞系MKN45、NCI-N87、AGS中的相对表达。2.通过RNA干扰(RNAi)技术沉默胃癌细胞系MKN45和AGS中cGAS表达,利用CCK-8增殖实验、细胞迁移实验、细胞划痕实验、细胞凋亡实验分析cGAS表达对胃癌细胞在体外增殖能力、侵袭性、凋亡率的影响。3.通过构建重组慢病毒质粒pLKO.1-sh-cGAS感染及嘌呤霉素筛选构建稳定敲低cGAS表达的胃癌细胞系MKN45和AGS,并通过裸鼠成瘤实验分析cGAS表达在体内对胃癌细胞MKN45增殖能力的影响。4.通过对TCGA数据库中384例胃癌患者肿瘤组织中与cGAS共表达的前200个基因进行GO生物学过程富集分析和KEGG通路富集分析来找出cGAS显著的生物学功能注释。通过彗星实验验证cGAS与基因组不稳定性之间的关系。5.通过R(Pheatmap)与 R(corrplot)软件包进行TCGA数据库胃癌样本.中cGAS基因表达的共聚类分析,分析与cGAS基因表达关联性最高的基因。6.通过免疫印迹检测稳定敲低cGAS的胃癌细胞系AGS中DNA损伤标记蛋白γ-H2AX及同源重组修复关键蛋白RAD51、CtIP、pCtIP、MRE11,pMRE11的表达水平,及免疫荧光检测γ-H2AX及RAD51在细胞内的定位,来分析cGAS对DNA同源重组修复的影响。7.通过K-M plotter数据库在线分析cGAS差异表达与胃癌患者预后之间的关系。结果1.TCGA数据库中数据显示cGAS在胃癌组织中相对正常人胃组织呈现高表达(P<0.0001);免疫组化结果显示在胃癌患者肿瘤组织中相对癌旁组织高表达(P<0.001)。实时荧光定量qPCR结果显示在3株胃癌细胞系MKN45、NC I-N87、AGS中cGAS在mRNA和蛋白质水平的表达均高于“正常”胃上皮细胞系GES-1。2.细胞功能实验表明胃癌细胞系MKN45和AGS中沉默cGAS表达后,相比对照组,肿瘤细胞在体外增殖率下降,细胞迁移率和划痕修复能力下降,但细胞凋亡增加。而在体外荷瘤试验中,沉默cGAS表达的MKN45细胞组其瘤块生长更慢,体积更小。3.GO功能和KEGG通路富集分析发现cGAS在胃癌组织中生物学功能上主要参与细胞分裂、有丝分裂核分离及DNA复制、DNA修复等10个生物学功能上,而cGAS主要参与DNA复制等10个信号通路;彗星实验表明cGAS过表达的GES-1细胞基因组不稳定性增加。4.WB实验表明胃癌细胞系AGS中敲低cGAS后,响应DNA损伤剂依托泊苷诱导的DNA损伤标记蛋白γ-H2AX表达减少,同源重组修复关键蛋白RAD51,pCtIP,pMRE11的表达减少,免疫荧光结果证实细胞核内RAD51 foci的增加。5.cGAS高表达与胃癌患者的性别(P=0.691)、年龄(P=0.523)、分化程度(P=0.123)、浸润深度(P=0.648)、淋巴结转移(P=0.383)、分级(P=0.849)等均无相关性,但生存分析表明cGAS低表达的胃癌患者具有更好的远期生存率。结论cGAS在胃癌组织中高表达,通过抑制DNA损伤后HR修复过程来促进基因组应激条件下的胃癌细胞恶性行为,有望成为胃癌诊治过程的新靶点。