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癌症是一种致死性强的恶性肿瘤。因此,找到有效且低毒副作用的治疗方法尤为迫切,目前针对晚期癌症的治疗方法主要是化疗和放射性治疗,但严重的毒副作用以及耐药性限制化疗在临床上的使用。产生耐药性的机制很多,包括细胞凋亡抑制、药物排出和增殖增加,从而降低药物的有效性。肿瘤细胞药物外溢的一种更为广泛的机制可归因于mdr1基因的失调,导致该蛋白的异常高表达。FoxM1在多种癌症中高表达,广泛参与肿瘤细胞恶性增殖、侵袭与转移、耐药性等过程,是有潜力的预后标志。本实验室前期通过噬菌体随机十二肽库筛选技术,成功获得了对FoxM1c-DBD具有高亲和力的结合肽P201,且已证实修饰后的多肽9R-P201可以抑制肝癌细胞HepG2的增殖、迁移与侵袭等发展过程、并诱导细胞调亡。本研究以多肽9R-P201为对象,深入探讨其与5-Fu联合用药对肝癌细胞HepG2及其5-Fu耐药细胞HepG2/R的协同杀伤作用及抗耐药分子机制及其作用机理。首先,我们以HepG2细胞以及5-Fu耐药的HepG2/R细胞为研究对象,初步研究了联合用药(P201+5-Fu)对细胞的抑制杀伤作用。通过形态学观察以及CCK-8法检测到联合用药对两种细胞均有较强的杀伤作用,且杀伤效果显著强于5-Fu和P201单独用药,值得注意的是,在P201浓度为45.0μg/mL时,其对HepG2/R细胞的抑制杀伤作用(67%)显著强于其对亲本HepG2(43%)细胞的杀伤作用。平板克隆形成、细胞划痕以及transwell小室实验均发现联合用药有效抑制这两种细胞的增殖和体外迁移能力。同时,通过AO/EB荧光双染及Annexin V-FITC流式细胞凋亡检测相互印证了联合用药有效促进HepG2细胞以及HepG2/R细胞产生凋亡。以上实验结果进一步为qRT-PCR和Western blot实验证实:经联合用药处理后两种细胞中FoxM1、mdr1、bax在mRNA水平的表达量均显著下调,且HepG2细胞中FoxM1和mdr1的表达量显著低于耐药细胞,差异极显著(P<0.001)。抑癌基因foxo3a均显著上调。与单独用药相比,联合用药组抑制FoxM1和mdr1表达的能力更强,以上结果在蛋白水平得到证实,且ABCG2在蛋白水平下调,有统计学意义(P<0.05)。最后,通过RNA转录组测序分析各处理基因差异表达情况,亲本HepG2细胞与5-Fu耐药的HepG2/R细胞差异表达基因共有2686个,HepG2/R细胞对照组和P201单药以及联合用药组差异表达基因分别有1596,2998个,而与5-Fu处理组只有784个差异表达基因。各处理差异表达基因富集较高的大多是参与细胞过程以及各种代谢活动的功能,同时,差异基因参与的信号通路主要在细胞增殖,凋亡、肿瘤形成方面的富集率较高。综上,我们认为9R-P201可以通过靶向FoxM1的抑制逆转5-Fu耐药的HepG2/R细胞中的mdr1表达,从而逆转HepG2细胞的5-Fu抗性,提高5-Fu抗癌的敏感性和维持细胞内5-Fu药物浓度,从而增强细胞的杀伤作用。两种药物联合使用,对HepG2细胞的抑制杀伤作用明显强于各单药。