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J亚群禽白血病（Subgroup J Avian Leukosis）是由反转录病毒科J亚群禽白血病病毒（AvianLeukosis Virus of Subgroup J，ALV-J）引起的一种传染性致骨髓细胞瘤疾病或成髓性白血病。该病自20世纪80年代末发现以来，以垂直和水平传播两种形式在世界各国肉种鸡及商品肉用型鸡中广泛流行，引起肉种鸡死亡和消瘦，严重生长发育不良，发生机体免疫抑制，给世界各国养鸡业带来了极大的危害。近年来，世界各国均采取措施，通过淘汰患病鸡群，减少垂直传播从而达到净化种群的目的，而我国这方面的工作相对滞后。因此，在国内进行该病的流行病学研究、分离鉴定病毒株并进行其分子生物学特性研究、建立国内适用的血清学诊断方法对国内防制该病流行、开展种群净化具有重大意义。 本研究首先采用ALV-J特异性引物，用RT-PCR检测患鸡病料、PCR检测细胞培养获取的前病毒基因组、基因序列测定、细胞培养物接种动物等方法从黑龙江省哈尔滨市以及吉林省某种鸡场送检的患病鸡体内，分离鉴定了两株ALV-J病毒，分别命名为Hrb-1和JL-2株。采用依据参照毒株HPRS-103cDNA序列设计并合成的一对引物，自Hrb-1和JL-2前病毒DNA中PCR扩增得到了Hrb-1和JL-2株囊膜基因，分别构建了重组质粒pMD18-T-Hrb-1／env和pMD18-T-JL2／env。在序列测定的基础上，对gp85和gp37基因片段的核苷酸序列及其推导氨基酸序列与国际上不同的参照毒株以及国内部分分离株进行了比较分析，结果表明Hrb-1与JL-2病毒株间gp85、gp37基因的同源率分别为91.5％和92.7％，推导的gp85氨基酸序列的同源率为85.3％，遗传变异分析结果表明JL-2和Hrb-1分别与美国病毒株ADOL-HC-1和UD3有着较大的亲缘关系。 本研究根据原核表达载体pGEX-6p-1的酶切图谱，设计了另一对特异性引物，克隆了JL-2前病毒基因组中的gp85基因片段。构建了原核表达载体PGEX-6P-1／gp85，经转化大肠杆菌BL21（DE3）后获得高效表达。薄层扫描分析结果表明，表达产物占菌体总蛋白的31.8％。Western blott结果表明，该表达产物具有生物学反应活性，分子量约为57KD。随后，本研究以纯化后的蛋白作为抗原建立了ELISA抗体诊断方法，通过对ELISA诊断方法特异性、敏感性及对工作条件的优化试验，确定了反应的最佳程序。统计学分析51份阴性血清的检测结果，得出判定标准。相关试验结果表明，该诊断方法与鸡传染性法氏囊病等十余种禽类病毒性传染病的阳性血清无交义反应，特异性好。SPF鸡在攻毒后10天即可监测到ALV-J抗体，具有较好的敏感性。与国外试剂盒对比试验结果表明，两者具有较高的符合率。此外，同一批次抗原的批内与批间重复性试验及不同批次抗原的重复性试验结果表明，该方法具有良好的重复性。现地应用试验结果表明，某现地养鸡场3个鸡群78只、306只和92只受检鸡的检测阳性率分圳为7.6％、9.8％、59.7％；与国外ALV-J gp85 ELISA诊断试剂盒的符合率分别为89％、95.5％、86.4％。中国农业科学院博l..论文摘要 总之，本研究首次白东北地区分离鉴定了两株ALv一J病毒，通过遗传变异分析，获取了国内东北地区ALV一J的分子流行病学资料。成功地表达了JL一2株gp85基因，并以其为抗原，建立了J亚群禽白血病抗体EL工SA检测方法，为国内各养鸡场有效开展J亚群禽白血病血清学调杳、种群净化提供了有效的技术手段，同时为开展国际间ALV一J的合作研究奠定了基础。