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前言前列腺癌是西方国家老年男性常见的恶性肿瘤，占男性死亡原因第2位。中国是前列腺癌发病率较低的国家，2002年的标化发病率为16／10万，远低于美国的124.8／10万，但随着我国经济的不断发展，人民生活水平的不断提高，饮食构成和生活习惯逐渐西方化，我国前列腺癌的发病率呈明显增高趋势。我国前列腺癌在男性泌尿、生殖系统恶性肿瘤中发病率跃居第三位。治疗侵袭性前列腺癌以及复发前列腺癌，最常用的方法是雄激素撤除疗法。然而在采用这种治疗18-24个月后，前列腺癌细胞不可避免的转化成雄激素非依赖性，此时治疗方法极其有限。前列腺组织表达雌激素受体（ER）α和ERβ。在正常前列腺上皮发现ERβ表达，而在前列腺癌中其表达明显减少。ERα的大量表达与前列腺癌的进展，转移和激素抵抗相关。这些研究表明ER可以是治疗前列腺癌的理想目标。雌激素治疗早就被认为是治疗广泛转移性前列腺癌的一种有效的激素剥夺疗法。选择性雌激素受体调节剂（SERMs）是一类通过阻止激素和受体结合来抑制雌激素作用的化合物。他莫昔芬和雷洛昔芬是其中的两种药物，他莫昔芬主要用于治疗乳腺癌，雷洛昔芬用来预防骨质疏松和乳腺癌。最近实验表明雌激素、他莫昔芬和雷洛昔芬都可以抑制前列腺癌的生长。丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK）包括三个亚家族：细胞外调节的蛋白激酶（ERKs）；c-Jun N末端蛋白激酶（JNKs）；和p38蛋白激酶（p38 kinase）。研究表明雌激素和他莫昔芬以及雷洛昔芬通过ER介导可以激活MAPK信号通路。本研究分别探讨了17β雌二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬通过ER激活MAPK通路对前列腺癌细胞PC3生长的影响。材料与方法1、17β雌二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬对PC3细胞生长的抑制作用不同浓度17β雌二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬作用PC3细胞48、72、96、120h后，应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检细胞生长抑制率。细胞生长抑制率（％）=(1—试验组光A490／对照组光A490)×100％。实验重复3次。2、细胞凋亡形态学检测17β雌二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬作用PC3细胞48 h后，按照试剂盒说明应用Hoechst染色检测细胞凋亡形态学变化，荧光显微镜下观察。3、免疫组织化学方法检测Bcl-2和caspase-3表达17β雌二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬作用PC3细胞48 h后，按照博士德免疫组织化学试剂盒说明染色，显微镜下观察Bcl-2和caspase-3的表达强度。4、ERK1／2、JNK和p38活性的测定17β雌二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬作用PC3细胞不同时间后，提取蛋白，Bradford法测定蛋白浓度，应用western blot检测PC3细胞中磷酸化的ERK1／2（p-ERK1／2）、磷酸化的JNK（p-JNK）和磷酸化的p38（p-p38）的表达，以及ERK1／2，JNK和p38的表达，以p-ERK1／2／ERK1／2、p-JNK／JNK和p-p38／p38代表MAPK的激活量。分别应用10μmol／l MEK1／2抑制剂PD98059、JNK抑制剂SP600125和p38抑制剂SB203580预先和细胞孵育1h后应用17β雌二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬作用30min，应用western blot检测ERK1／2、JNK和p38的活性，明确上述抑制剂抑制药物对MAPK的激活作用。5、细胞周期分布检测收集经不同药物处理48h后的细胞，PI染色法用流式细胞仪检测细胞亚二倍体峰和细胞周期分布，应用CellQuest 3.0软件采集数据，应用ModFit软件分析，结果用百分率表示。6、ERα、ERβ、细胞周期蛋白依赖激酶抑制蛋白(P21WAF1)、细胞周期蛋白D1（cyclinD1）基因表达的检测收集经不同药物处理或未处理18h后的细胞，Trizol提取总RNA，应用TaKaRa公司的RT-PCR试剂盒扩增上述基因，PCR产物1.5％琼脂糖凝胶电泳后，生物图象分析仪检测吸收光度值进行半定量分析。7、TUNEL染色检测细胞凋亡率不同药物作用PC3细胞48h后，按照博士德TUNEL试剂盒说明染色，显微镜下观察，凋亡细胞核呈棕黄色，每张切片随机选取10个高倍视野，计数100个细胞，以其中凋亡细胞占的百分比作为细胞凋亡率。8、Bcl-2、caspase-3、Bax、p-Bcl-2的表达不同药物作用PC3细胞特定时间后，提取蛋白，Bradford法测定蛋白浓度，应用western blot检测PC3细胞中上述蛋白表达的变化。9、统计学分析各组间比较采用单因素方差分析。结果RT-PCR在PC3细胞中检测到ERα和ERβ表达，并且发现其表达ERα异构体。MTT检测发现17β雌二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬呈浓度依赖性抑制PC3细胞增殖。17β雌二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬抑制PC3生长的最小浓度分别为10-5mol／l、10-6mol／l和10-7mol／l。10-4 mol／l 17β雌二醇、10-5mol／l他莫昔芬和10-6mol／l雷洛昔芬分别作用48h后，Hoechst染色在处理组发现典型凋亡改变，正常细胞核呈蓝色，凋亡细胞核呈致密浓染和呈碎块状致密浓染的典型凋亡表现。免疫组织化学发现10-4mol／l 17β雌二醇、10-5mol／l他莫昔芬和10-6mol／l雷洛昔芬分别作用48h后，PC3细胞中Bcl-2的表达比对照组表达减少，caspase-3的表达则比对照组表达增加。Western blot检测表明在10-4 mol／l 17β雌二醇和10-5mol／l他莫昔芬在PC3细胞中以时间依赖的方式瞬间激活ERK1／2、JNK和p38信号通路。而10-6mol／l雷洛昔芬仅激活ERK1／2和p38信号通路，但不激活JNK通路。10μmol／l PD98059、SP600125和SB203580分别预先和细胞孵育1h则可以完全抑制上述药物对MAPK信号通路的激活。流式细胞检测发现10-4mol／l 17β雌二醇作用48h后PC3细胞周期阻滞于G1期，10μmol／l PD98059预处理1h后使10-4mol／l 17β雌二醇作用48h的细胞进一步阻滞在G1期，10μmol／l SP600125预孵育1h后减轻10-4mol／l 17β雌二醇作用48h引起的细胞周期阻滞，10μmol／l SB203580预孵育1h后则使10-4mol／l 17β雌二醇作用48h的细胞进入S期。10-5mol／l他莫昔芬作用48h后PC3细胞周期阻滞于G1期，10μmol／l PD98059预处理1h后使10-5mol／l他莫昔芬作用48h的细胞轻度阻滞在G1期，10μmol／l SP600125预孵育1h后10-5 mol／l他莫昔芬作用48h细胞依然阻滞在G1期，10μmol／l SB203580预孵育1h后则使10-5mol／l他莫昔芬作用48h的细胞进入S期。10-6 mol／l雷洛昔芬作用48h后PC3细胞周期阻滞于G1期，10μmol／l PD98059预处理1h后使10-6mol／l雷洛昔芬作用48h的细胞轻度阻滞在G1期，10μmol／l SB203580预孵育1h后则使10-6mol／l雷洛昔芬作用48h的细胞周期轻度阻滞在G1期。RT-PCR发现10-4mol／l 17β雌二醇作用组的cyclinD1和P21WAF1表达量分别为对照组的0.42±0.03和3.13±0.02倍；10-4mol／l 17β雌二醇+10μmol／l PD98059作用组的cyclinD1和P21WAF1基因表达分别为对照组的0.21±0.03和3.08±0.05倍，10-4mol／l 17β雌二醇+10μmol／l SP600125作用组的cyclinD1和P21WAF1基因表达分别为对照组的0.43±0.01和1.31±0.04倍；10-4mol／l 17β雌二醇+10μmol／lSB203580作用组的cyelinD1和P21WAF1基因表达分别为对照组的2.81±0.02和3.14±0.02倍。10-5mol／l他莫昔芬作用组的cyclinD1和P21WAF1表达量分别为对照组的0.40±0.05和4.37±0.12倍；10-5mol／l他莫昔芬+10μmol／lPD98059作用组的cyclinD1和P21WAF1基因表达分别为对照组的0.41±0.05和1.74±0.10倍，10-5mol／l他莫昔芬+10μmol／l SP600125作用组的cyclinD1和P21WAF1基因表达分别为对照组的0.43±0.06和4.36±0.23倍，10-5mol／l他莫昔芬+10μmol／l SB203580作用组的cyclinD1和P21WAF1基因表达分别为对照组的3.92±0.22和4.46±0.09倍。10-6mol／l雷洛昔芬作用组的cyclinD1和P21WAF1表达量分别为对照组的0.50±0.02和4.48±0.12倍；10-6mol／l雷洛昔芬+10μmol／lPD98059作用组的cyclinD1和P21WAF1基因表达分别为对照组的0.49±0.02和1.07±0.06倍，10-6mol／l雷洛昔芬+10μmol／l SB203580作用组的cyclinD1和P21WAF1基因表达分别为对照组的2.36±0.08和4.50±0.03倍。处理因素作用48h后，TUNEL染色发现凋亡细胞，正常细胞核呈蓝色，而凋望细胞核呈棕色。对照组细胞凋亡率为0.9±0.1％，10-4mol／l 17β雌二醇处理组的凋亡率为23.0±1.4％，10-4mol／l 17β雌二醇+10μmol／l PD98059处理组的凋亡率为30.0±1.2％，10-4mol／l 17β雌二醇+10μmol／l SP600125处理组的凋亡率为10.6±0.8％，10-4mol／l 17β雌二醇+10μmol／l SB203580处理组的凋亡率为14.6±0.7％。10-5mol／l他莫昔芬处理组的凋亡率为41.5±1.9％，10-5mol／l他莫昔芬+10μmol／lPD98059处理组的凋亡率为36.3±1.9％，10-5mol／l他莫昔芬+10μmol／l SP600125处理组的凋亡率为27.0±1.6％，10-5mol／l他莫昔芬+10μmol／l SB203580处理组的凋亡率为17.4±2.0％。10-6 mol／l雷洛昔芬处理组细胞的凋亡率为22.9±1.5％，10-5mol／l雷洛昔芬+10μmol／l PD98059处理组的凋亡率为15.2±1.8％，10-5mol／l雷洛昔芬+10μmol／l SB203580处理组的凋亡率为9.7±0.6％。Western blot检测发现10-5mol／l他莫昔芬作用PC3细胞48h后，Bcl-2的表达减少，而caspase-3的表达增加。10μmol／l PD98059预先孵育1h，对10-5mol／l他莫昔芬引起的PC3细胞中的caspase-3和Bcl-2的变化没有影响；应用10μmol／lSP600125和SB203580与PC3先孵育1h，则分别抑制10-5mol／l他莫昔芬引起的PC3细胞中的Bcl-2的表达减少和caspase-3表达增加。他莫昔芬作用PC3细胞6h后p-Bcl-2的表达增加，应用10μmol／l SP600125和SB203580与PC3先孵育1h后，分别部分抑制了他莫昔芬引起的p-Bcl-2的表达增加，但PD98059则无此作用。10-6mol／l雷洛昔芬作用PC3细胞48h后，Bcl-2的表达减少，而caspase-3和Bax的表达增加。10μmol／l PD98059预先孵育1h，可以抑制10-6mol／l雷洛昔芬引起的PC3细胞中的caspase-3、Bax的表达增加；应用10μmol／l SB203580与PC3先孵育1h，则可以抑制10-6mol／l雷洛昔芬引起的PC3细胞中的Bcl-2的表达减少和caspase-3的表达增加。雷洛昔芬作用PC3细胞6h后p-Bcl-2的表达增加，而应用10μmol／l SB203580与PC3先孵育1h后，抑制了雷洛昔芬引起的p-Bcl-2的表达增加，但PD98059则无此作用。结论17β雌二醇通过持续激活JNK增加P21WAF1基因表达，同时激活p38减少cyclinD1表达，使细胞阻滞在G1期。其还通过持续激活JNK和p38通路引起PC3细胞凋亡。但17β雌二醇同时通过激活ERK1／2通路又可以轻微拮抗上述作用。他莫昔芬通过持续激活ERK1／2增加P21WAF1基因表达，同时激活p38减少cyclinD1表达，进而使细胞阻滞在G1期。其还通过持续激活JNK和p38引起Bcl-2磷酸化使Bcl-2失效降解，促进PC3细胞凋亡。雷洛昔芬通过持续激活ERK1／2增加P21WAF1基因表达，同时激活p38减少cyclinD1表达，进而使细胞阻滞在G1期。雷洛昔芬通过激活p38引起Bcl-2磷酸化使Bcl-2失效降解，同时通过持续激活ERK增加Bax的表达引起PC3细胞凋亡。上述实验结果为应用雌激素和选择性雌激素受体调节剂治疗雄激素非依赖性前列腺癌提供了实验基础。