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随着分子生物学技术的发展，人们对猪水肿病的致病因子和致病机理有了较深入的了解，对其致原菌毒素(Shiga-like toxin Ⅱ virant，SLT-Ⅱv或SLT-Ⅱe，以下简称水肿病毒素)的分子生物学特性已有了较多的研究，其中包括SLT-Ⅱe基因的克隆与测序。SLT-Ⅱe操纵子全长为1980bp，由两个亚单位基因构成——SLTⅡeA和SLT-ⅡeB。其中A亚单位是SLT-Ⅱe的毒性亚单位，B亚单位是SLT-Ⅱe的保护性抗原的所在处。该病在世界各国都有发生，发病后死亡率达80％～100％，给养猪业带来了较大的损失。 本研究在SLT-ⅡeB亚单位基因克隆、定序及在菌细胞内表达的基础上，利用菌体表面表达抗原技术，构建大肠杆菌表面表达SLT-ⅡeB的重组菌，旨在对其作为黏膜疫苗而激发的黏膜免疫反应进行初步的研究。 用聚合酶链式反应(PCR)技术，从大肠杆菌PPSLT-ⅡeB中扩增出204bp的SLT-ⅡeB基因的编码序列，从金黄色葡萄球菌中扩增出621bp的SPA细胞壁固定区序列(SPA-X)，将扩增的SLT-ⅡeB与SPA-X基因片段连接后克隆进pEZZ-18载体，转化到大肠杆菌HB101后，经酶切分析等方法筛选到阳性的重组质粒pZBSPAX，并对该重组质粒进行序列测定，证明了该重组质粒就是同时含有SLT-ⅡeB和SPA-X的克隆。 通过在不同温度、不同培养时间及IPTG诱导条件下重组菌PZBSPAX融合蛋白表达的检测，利用免疫荧光抗体技术及免疫胶体金技术，证明重组大肠杆菌PZBSPAX可表面表达PP-SLT-ⅡeB-SPAX融合蛋白；利用SDS-PAGE、Western-blotting对重组大肠杆菌PZBSPAX的表达产物进行分析，结果表明该重组菌表达的融合蛋白PP-SLT-ⅡeB-SPAX与预期的大小一致，且具有SLT-ⅡeB的抗原性。 用重组菌PZBSPAX口服免疫1日龄和15同龄仔猪，通过对免疫后1d、3d、7d、10d、15d、30d的粪检菌的抗氨苄青霉素试验及对其进行质粒酶切分析，显示该重组菌能稳定地定居于仔猪肠道至少30天(至实验结束时)；利用间接ELISA方法对免疫后10d、15d、30d仔猪肠黏液特异性SIgA及血清特异性IgA、IgG进行了检测，并对其OD值与非免疫对照组及与由载体菌(HB101大肠杆菌)包被酶标板后检测的OD值进行了比较分析，结果显 扬州大学博卜学位论文示了重组菌PzBS队x经仔猪口服后能产生较高水平的肠勃液特异性SlgA和血清特异性IgA、IgG，提示该重组菌作为口服疫苗可激发仔猪肠勃膜免疫反应，同时也可引起全身性体液免疫反应。 本研究成功地构建了革兰氏阴性菌(HB 1 01)的表面表达载体系统，并成功地将仔猪水肿病毒素保护性抗原一B亚单位在其表面表达，这在国内外的相关文件中尚未见报道，而有关豁膜疫苗在猪体内激发的豁膜免疫反应的研究在国内外同样较少报道。相信本研究所构建的细菌表面表达猪水肿病毒素保护性抗原的重组菌作为勃膜疫苗预防仔猪水肿病将具有较广阔的应用前景，也相信该表面表达的活细菌载体系统的成功构建会为其它疾病的勃膜疫苗的研制提供一种方法和思路。