巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。它含有两个醇氧化酶基因,aox1和aox2,它们具有强诱导型启动子,可被甲醇诱导并被葡萄糖、甘油抑制。由于巴斯德毕赤酵母具有高生长速率,能够在简单、廉价的培养基中生长,适合用于小规模发酵和大规模生产,且具有真核表达系统的翻译后修饰机制,而被广泛地用于重组DNA技术生产蛋白质。Gt1（glycerol transporter 1,GenBank:CP014715.1）基因编码巴斯德毕赤酵母的甘油转运体1（GT1）。GT1是跨膜蛋白,具有将甘油从胞外转运至胞内的功能。根据前期研究,在毕赤酵母GS115△gt1中,zrt1（GenBank:CP014717.1）的mRNA水平增高,暗示着GT1可能与ZRT1具有功能相似性,GT1能够行使转运甘油之外的其他功能。首先根据NCBI分析比对,毕赤酵母zrt1与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中编码高亲和力锌转运蛋白的zrt1（zinc-regulated transporter 1,GenBank:CP029160.1）相似。HMMTOP跨膜段预测显示:GT1具有十二段疏水结构域,ZRT1具有七次疏水结构域,TMPres模拟两蛋白的二维拓扑结构,发现其均具有一个位于中间跨膜段的胞内loop结构,且分别具有典型的金属结合基序,如组氨酸基序、半胱氨酸基序,这些位点有助于蛋白与底物Zn²⁺的结合且发挥转运功能。针对两个蛋白性质,分别构建了GT1、ZRT1过表达菌株、敲除菌株,以及RFP融合表达菌株。纯化获得了GT1和ZRT1,并测定了其与底物体外的平衡解离常数、Zn²⁺消耗水平、体内mRNA水平、翻译水平、观察其亚细胞荧光定位。与预测结果相符,两个蛋白均可在体外结合锌离子,且ZRT1与Zn²⁺的结合亲和力（6.63μM）高于GT1（16.4μM）。进一步通过RFP融合蛋白的亚细胞荧光定位确定,两个蛋白均位于毕赤酵母细胞膜上。利用Zn²⁺荧光定量法检测敲除菌株△gt1、△zrt1、△gt1△zrt1的锌消耗水平来验证GT1和ZRT1的Zn²⁺摄入能力。检测到敲除菌生长过程中胞外培养基中Zn²⁺的浓度均高于出发菌株,发现这两个蛋白的缺失使细胞在低锌培养基中的锌摄入活性下降。此外,高锌能导致zrt1的转录水平和蛋白水平下调,并且使蛋白从细胞质膜上解离,内化到液泡中。Gt1仅在甘油培养基中受锌的调控,而GT1蛋白作为甘油转运体受葡萄糖诱导失活。因此,GT1和ZRT1可在甘油为碳源时维持细胞内锌稳态,而GT1在葡萄糖为碳源时的功能阻断可能导致了ZRT1的上调。这些结果暗示着GT1和ZRT1受不同的机制调控,并且它们能在特定条件下发挥转运锌或锌配体的功能以维持细胞内锌稳态。本研究为挖掘GT1的功能提供了新的思路,并且成功鉴定了GT1的一项新功能,为GT1在甘油阻遏中对金属辅助因子锌离子的影响进行了初步探索,同时为真核膜蛋白的体外功能研究提供了参考,为膜蛋白GT1的结构研究奠定了工作基础。