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目的:在男性不育症中特发性无精子少精子症是数量较多、病情较重的一种,病因一直不明确。该基因型与表型的关系尚未见报道,纠其原因可能缺少进行睾丸活检的共同方案及组织病理学分类标准。现研究男性特发性无精子少精于症患者的无精子因子基因(azoospermia factor,AZF)的AZFa,AZFb,AZFc,AZFd 4个区域缺失情况与睾丸活检病理(testicle biopsy for pathology)等表型的关系。卵胞内单精子注射(ICSI),为男性不育症的治疗带来了革命性突破,但也有可能使遗传缺陷传给下一代,导致子代不育。因此,本实验探讨特发性男性不育症患者精液、睾丸病理与AZF基因及其相互关系有着重大的临床意义。(1)为原因不明的男性生不育症作出病因学上的诊断。通过睾丸病理和AZF微缺失的检测,可以找到精子生成检查的缺陷和一些不必要的药物和手术治疗。(2)由于AZF微缺失有可能通过垂直传播给男性后代,通过术前筛查可以切断这种遗传途径。(3)为基因缺失的男性不育症治疗提供了线索。(4)为男性避孕的研究开拓了思路。方法: 50名正常生育男性、100例不育男性(50例无精子症和50例严重少精子症患者)和1名正常女性外周血标本做PCR检测,其中正常生育男性精液常规检查精子数均>20×106/ml。不育男性年龄28～42岁,平均34岁,平均不育年限5.8年,临床检查排除精索静脉曲张隐睾、附睾损伤以及阻塞性无精症(结合精液pH值、精浆果糖、α-2糖苷酶)等疾病,且无特殊病史及家族史;按照WHO标准连续3次精液常规分析确诊为无精子症50例,严重少精子症(2～5×106 /ml)50例;外周血常规染色体核型分析均为46XY;血清激素浓度均在正常范围,不育组患者自愿行睾丸活检送病理和精液常规。实验对象均行PCR检测,外周血细胞制备DNA模板,取抗凝血1 ml,加入5倍体积重蒸馏水溶解红细胞,离心后去上清液,收集白细胞团块,加入300u1 STE , 21u1 SDS, 4u1蛋白酶K后56℃2小时;等体积酚、氯仿、异戊醇抽提,取水相加1/10体积3mol/LNaAc, 2倍体积冰乙醇沉淀DNA,离心浓缩DNA,4℃保存备用;聚设计合酶链反应引物,共有段含有SY-14,AZFa段含有SY-86和SY-84,AZFb段含有SY-134和SY-127,AZFc段含有SY-254和SY-255,AZFd段含有SY-153和SY-152;配置五种不同基因30ul反应体系中所含的各试剂量(ul);调整PCR扩增参数及最后置4℃保温;检测PCR反应及产物,用1%琼脂糖凝胶电泳,60 V恒压电泳30 min ,嗅乙锭染色后在紫外线灯下观察结果,并照相保存。PCR反应中均设正常男性和女性对照。结果:入选的150份男性标本,经PCR检测均检出SRY基因特异片段,表明所检取的DNA模板符合要求整个扩增系统有效。该片段扩增长度为472bp,与待检测的片段有区别,并能够以此作为内参照。1名女性阴性对照未见上述9条扩增带,以此作为外参照。50名生育的正常男性标本均可见共有段SY-14(SRY),AZFa / SY-86和SY-84,AZFb / SY-134和SY-127 (RBM1 ), AZFc /SY-254和SY-255(DAZ ) ,AZFd/ SY-153和SY-152扩增带,表明无AZF基因微缺失。100例患者标本中均可见SY-14(SRY)表明均为男性基因,其中有17例患者有AZF基因微缺失(AZFc有11例, AZFb有3例, AZFcAZFb有2例, AZFaAZF c有1例),基因区域序列标签位点(sequence tagged site,STS)微缺失有20个(无精子症11个;严重少精子症9个),例如∶AZFc微缺失可见SY-14(SRY)扩增带,但未见AZFc /SY254(DAZ )扩增带,表明有DAZ基因缺失;其中无精子症组有2例同时未见AZFb /YRRM1(RBM1 )和AZFc /SY254(DAZ )扩增带,表明同时有RBM和DAZ基因缺失;其中严重少精子症组有1例同时未见AZFa / SY145和AZFc /SY254(DAZ )扩增带,表明同时有AZFa和DAZ基因缺失。为排除假阳性反应,对这20例标本进行3次PCR重复检测,仍无上述相应AZF微缺失基因扩增信号,而SRY能正常扩增者,证实相应缺失基因微缺失的存在。睾丸病理也呈一定的异常改变。结论:目前Y染色体微缺失研究能够提供的信息:①AZFa区微缺失患者表现为仅有支持细胞细胞,有报道25%有部分精子生成受抑而表现严重少精子,一般不采用睾丸精子穿刺(testicular spermaspiration,TESE)治疗,减少机械性损伤。这种患者可以采取基因治疗,从根本上找出病因对相关基因敲除或导入;②AZFb区微缺失患者通常病理表现为精子生成受阻在精母细胞阶段(生精上皮脱落紊乱和生精阻滞),该区缺失患者亦不提倡采取TESE-ICSI治疗,理论上可采取体外精子成熟,将精母细胞通过体外培养成熟,然后可通过各种辅助生殖技术获得后代;③AZFc微缺失患者,精子计数从无到正常但多伴精子形态异常。病理类型均可见到,与SCOSII型相关(一些精原细胞出现,并有有限的精子生成或精子生成很少),AZFc区微缺失临床最为常见,可以通过各种辅助生殖技术繁育后代。针对AZFc区缺失的少精子患者应尽早进行治疗或冷冻保存精液。在辅助生殖中,尽量选择女婴,切断遗传途径。为了后代的健康,对无精子症、严重少精子症患者,均需同时进行Y染色体和睾丸病理的检测,特别是在其实行ICSI治疗之前。建议对于特发性男性不育的睾丸病理与不明原因的女性习惯性流产与AZF基因微缺失的相关性做进一步相关研究,建议在各种肿瘤疫苗和AZF基因缺失的检测技术成熟的基础上进一步开展无精子症、严重少精子症的疫苗的相关研究。