肺癌是发病率高、预后差的恶性肿瘤之一,近年来,其发病率和病死率在我国呈上升趋势。以手术、化疗、放疗为主的综合治疗是肺癌的主要治疗方法,但疗效尚不理想,目前肺癌患者总的5年生存率仍低于15%。因此亟待寻找治疗肺癌的更为有效的手段。生物治疗是继手术、放疗及化疗之后兴起的一种新的治疗肺癌的方法,被认为是目前治疗肺癌极有前景的治疗手段。大量研究证明,有效的抗肿瘤细胞免疫反应的核心是产生CD8+的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T Lymphocyte,CTL)。利用CTL对肿瘤进行特异性杀伤,已经成为治疗恶性肿瘤的有力手段之一。现已明确,有效活化CTL反应关键是抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)能否将“第一信号”(抗原信号)和“第二信号”(共刺激信号)有效的传递给初始型T细胞。在所有的抗原递呈细胞中,功能最强大的则是树突状细胞(dendritic cell,DC),它表达高水平MHC分子、共刺激分子;能够吞噬处理凋亡或坏死肿瘤细胞等颗粒性抗原,具有“交叉递呈(cross-presentation)”外源性抗原的能力;也是机体有效激发CTL反应的枢纽。以往的研究证明:DC在体外能够高效吞噬肿瘤细胞的凋亡小体,获取抗原,从而诱导特异性CTL反应。随着DC体外分离、培养技术的成熟,各种以DC为基础的疫苗也应运而生,并在部分恶性肿瘤的治疗中取得了令人振奋的效果。然而,所有以DC为基础的疫苗制备必需经过DC的体外分离、培养、负载、成熟等步骤,这一临床操作过程繁琐,而且费用高。因此,寻找一种操作简便以树突状细胞为基础的免疫治疗策略迫在眉睫。目前已经证实,DC存在于体内多种组织中,如外周血单核细胞(PBMC)中有1%的细胞为DC,皮肤中也有DC的存在,即郎罕细胞。因此,可以通过趋化作用使体内DC向肿瘤局部募集而增加DC的数量。近期的研究表明,多种趋化因子,如巨噬细胞炎症蛋白-3α (macrophage inflammatory protein-3α,MIP-3α)、RANTES、MIP-1β和SDF-1等,在体内、外对DC均有趋化作用。其中,MIP-3α是一种对未成熟DC有强烈的趋化作用,而对成熟DC却无趋化作用的趋化因子。因此,我们设想:利用MIP-3α对未成熟DC的强烈趋化特性,将肿瘤周围组织,甚至远处的DC趋化到肿瘤局部,递呈肿瘤来源的外源性抗原,进而激发机体特异性抗瘤免疫应答。然而,这种设想的局限性是<WP=12>难于在体内有效活化CTL反应。其主要原因有以下两点:①DC只能吞噬凋亡或坏死的肿瘤细胞(即颗粒性抗原),难于有效吞噬正常的肿瘤细胞,因而无法实现“交叉递呈”肿瘤抗原的过程;②DC在吞噬外源性抗原后,必须经IL-1β、TNF-α等“危险信号(danger signal)”的刺激才能活化、成熟,而肿瘤局部缺乏上述“危险信号”,且未成熟的DC不但不能有效激发CTL反应,反而会加重机体对肿瘤的免疫耐受。放疗是肺癌的主要治疗方法之一,它引起肿瘤细胞死亡的最主要方式是细胞凋亡或坏死。放疗本身可以起到杀伤肿瘤细胞的目的,又能通过诱导肿瘤细胞凋亡或坏死,为DC提供有效的外源性抗原(凋亡或坏死的肿瘤细胞);还通过诱导免疫刺激因子的分泌,为DC提供成熟、活化必需的“危险信号”(IL-1β、TNF-α等免疫刺激细胞因子)微环境。基于上述认识,我们设想:若能将局部放疗结合MIP-3α基因治疗,MIP-3α可将DC募集至肿瘤组织,放疗不但可杀伤肿瘤细胞,还可提供DC“交叉激活”CTL反应所必需的条件。此外,放疗既可以对MIP-3α基因表达进行空间上的调控,使MIP-3α集中在肿瘤局部表达,从而吸引DCs高效聚集; 还可以进行时间上的调控,以避免MIP-3α的持续表达,而造成体内DC的无效消耗。 近年来活跃在基因治疗领域的早期生长反应-1基因(early growth response-1, Egr-1)启动子是我们对MIP-3α基因进行时间和空间上的调控的良好工具。Egr-1基因为即刻早期基因(immediate early genes, IEGs)家族成员,是一种含有3个锌指结构的转录因子。该转录因子可在辐射、缺氧等应激条件下被活化,通过与DNA序列上的顺式作用元件结合,进而诱导目的基因表达。Egr-1基因的5’端上游启动子区域含有3个Egr-1的结合元件和CarG盒,应激条件可通过诱导Egr-1、c-fos、c-jun等即刻早期基因的表达,使Egr-1基因的表达在体内呈逐级放大趋势。根据Egr-1在应激条件下表达的上述特性,有研究者设计用Egr-1启动子启动的TNF-α基因的表达系统进行放疗增敏实验,称为放射-基因治疗,取得了可喜的苗头。本研究基于DC在抗瘤免疫应答中的重要性和目前DC疫苗的缺陷,提出利用Egr-1启动子的局部放疗的反应,对MIP-3α基因表达的进行时空调控,激发机体抗瘤免疫应答的新设想。这种设想的工作原理如下:通过放疗诱导肿瘤局部DC趋化因子(MIP-3α)的表达,在MIP-3α的作用下,DCs向照射局部聚集,处理放疗后凋亡或坏死肿瘤细胞来源的肿瘤抗原,并在放疗局部存在的多种免疫刺激因子的作用下成熟、活化,从而“交叉激活”CTL反应。该设想一方面利用Egr-1启动下游基因表达具有超强而短暂的特性,使MIP-3α的表达随放射诱导按需开关,实现对MIP-3α基因表达调控,从而更有效的激发机体产<WP=13>生抗瘤免疫应答;另一方面,本研究有别于以往在Egr-1下游引入的目的基因是具备直接的肿瘤杀伤效应的“治疗性基因”,而是引入了在表达后可以引发一些后续的抗?