论文部分内容阅读
目的:子宫内膜癌（Uterine Corpus Endometrial Carcinoma,UCEC）是常见的妇科恶性肿瘤,近年来发病率在世界范围内呈上升且年轻化趋势,成为威胁女性健康的重要因素。因此,深入探究子宫内膜癌发生发展的分子机制,寻求合适的诊断标志和治疗靶点具有重要意义。随着高通量测序技术的发展,非编码RNA的功能逐渐被揭示。非编码RNA虽然缺乏编码蛋白的能力,但它们在编码基因的转录、转录后和翻译后调控中发挥重要作用。天然反义转录本（natural antisense transcripts,NATs）为非编码RNA家族的重要成员,是由反义链转录,并与正义链基因完全或部分重叠的RNA分子。近年的研究表明NATs可在多种肿瘤中异常表达,常通过顺式（cis）方式影响正义链基因或通过反式（trans）方式调节下游靶基因的表达,调控肿瘤的发生发展。最近的研究表明NATs在子宫内膜癌中表达异常并发挥重要功能,然而,NATs在子宫内膜癌中的研究尚处于初步探索阶段,仍需要大量的深入研究来证实NATs与子宫内膜癌发生发展的关系并明确其中的作用机制。本研究中,我们利用R语言对TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库中子宫内膜癌组织的转录组数据进行生物信息学分析,结合文献查新及功能实验,最终锁定到SOX9-AS1。组织数据显示SOX9-AS1在子宫内膜癌中异常高表达,在此我们将着重探索SOX9-AS1在子宫内膜癌增殖、凋亡、迁移、侵袭中的作用及内在机制。研究方法:1、利用TCGA数据库分析SOX9-AS1和SOX9在子宫内膜癌组织中的表达。利用ENCODE数据库分析SOX9启动子区组蛋白富集情况。2、利用核质分离实验明确SOX9-AS1的亚细胞定位。3、细胞培养与转染:利用SOX9-AS1质粒转染SOA9-AS1低表达的子宫内膜癌ISHIKAWA细胞,构建SOX9-AS1稳定过表达细胞系。利用反义寡核苷酸（Antisense oligonucleotides,ASO）转染SOX9-AS1高表达的HEC1B细胞,建立SOX9-AS1瞬时低表达细胞系。利用SOX9质粒转染HEC1B细胞,构建SOX9稳定高表达细胞系。利用si-SOX9转染HEC1B细胞,构建SOX9瞬时低表达细胞系。4、通过CCK8法在上述SOX9-AS1稳定高表达细胞系、瞬时低表达细胞系和SOX9瞬时低表达细胞系及各自对照组测定细胞增殖能力,分析SOX9-AS1和SOX9对子宫内膜癌细胞增殖能力的影响。5、利用Annexin VFITC/PI将上述SOX9-AS1稳定高表达细胞系、瞬时低表达细胞系和SOX9瞬时低表达细胞系及各自对照组染色,流式细胞术分析SOX9-AS1和SOX9对子宫内膜癌细胞凋亡的影响。6、划痕实验:在上述SOX9-AS1稳定高表达细胞系、瞬时低表达细胞系和SOX9瞬时低表达细胞系及各自对照组进行划痕实验,通过测定伤口愈合率,分析SOX9-AS1和SOX9对子宫内膜癌细胞迁移能力的影响。7、Transwell实验:在上述SOX9-AS1稳定高表达细胞系、瞬时低表达细胞系和SOX9瞬时低表达细胞系及各自对照组,利用Transwell实验明确SOX9-AS1和SOX9对子宫内膜癌细胞侵袭能力的影响。8、定量逆转录聚合酶链式反应（Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,q RT-PCR）:检测10对内膜癌组织及正常内膜组织中的SOX9-AS1和SOX9 m RNA表达情况。沉默SOX9-AS1后,检测SOX9-AS1和SOX9 m RNA表达情况;过表达SOX9-AS1后,检测SOX9-AS1和SOX9m RNA表达情况;沉默WDR5后,检测WDR5和SOX9 m RNA表达情况。9、Western blot:沉默SOX9-AS1后,检测SOX9蛋白表达情况;沉默WDR5后,检测WDR5和SOX9蛋白表达情况。10、RNA免疫沉降（RNA immunoprecipitation,RIP）:利用RIP实验检测SOX9-AS1与WDR5是否存在相互结合;11、染色质免疫沉降（Chromatin immunoprecipitation,Ch IP）:利用Ch IP实验检测H3K4me3在SOX9启动子区的富集情况。沉默SOX9-AS1后,检测H3K4me3在SOX9启动子区的富集情况的变化。12、裸鼠成瘤实验:利用HEC1B细胞完成裸鼠成瘤,待瘤体明显形成后随机将裸鼠分为两组;利用in vivo ASO-SOX9-AS1及ASO-NC进行瘤内注射。明确SOX9-AS1对子宫内膜癌细胞体内成瘤体积和质量的影响。结果:1、对TCGA数据库中子宫内膜癌组织的转录组数据进行分析,发现SOX9-AS1和SOX9显著高表达（P＜0.001）,且SOX9与SOX9-AS1的表达呈高度正相关。对10对内膜癌组织及正常内膜组织进行q RT-PCR检测,结果显示,与正常内膜组织相比,内膜癌组织中SOX9-AS1和SOX9的表达异常升高,且两者表达呈高度正相关。2、核质分离实验显示:SOX9-AS1主要定位于子宫内膜癌细胞HEC1B和ISHIKAWA细胞核内。3、功能实验:当HEC1B细胞瞬时低表达SOX9-AS1或SOX9后,细胞增殖和迁移能力明显降低（P＜0.001）、细胞凋亡（包括早期凋亡和晚期凋亡）显著增加（P＜0.001）、细胞侵袭能力明显下降（P＜0.01）。在SOX9-AS1过表达细胞系中,细胞的增殖、凋亡、迁移及侵袭能力均无变化。4、SOX9-AS1通过调节SOX9发挥生物学功能:沉默SOX9-AS1的表达能够显著逆转过表达SOX9后对细胞增殖的增强效应（P＜0.01）;沉默SOX9-AS1的表达能够显著逆转过表达SOX9后对细胞凋亡的抑制作用（P＜0.05）;沉默SOX9-AS1的表达能够显著逆转过表达SOX9后对细胞迁移、侵袭的促进效应（P＜0.01）。5、q RT-PCR和Western Blot实验结果显示:沉默SOX9-AS1的表达后,SOX9 m RNA和蛋白的表达显著降低（P＜0.001）;过表达SOX9-AS1后,SOX9的m RNA表达无显著变化。沉默WDR5的表达后,SOX9 m RNA和蛋白的表达显著降低（P＜0.001）。6、Ch IP实验结果显示:在HEC1B细胞中,H3K4me3在SOX9启动子区域高度富集;沉默SOX9-AS1后,H3K4me3在SOX9启动子区富集水平下降;7、RIP实验结果显示:SOX9-AS1在WDR5上高度富集（P＜0.001）。8、裸鼠成瘤实验结果:与对照组相比,利用ASO-SOX9-AS1沉默SOX9-AS1表达后,实验组瘤体体积、质量显著缩小（P＜0.01）。结论:1、SOX9-AS1在子宫内膜癌中的表达水平显著高于正常内膜组织;2、SOX9-AS1能够促进子宫内膜癌细胞增殖、迁移与侵袭,抑制细胞凋亡,促进子宫内膜癌细胞在体内成瘤。3、SOX9-AS1通过调控SOX9发挥生物学功能。4、在子宫内膜癌中高表达的SOX9-AS1通过结合WDR5调控SOX9启动子区域H3K4me3修饰,激活SOX9的表达,促进子宫内膜癌的发生发展。