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目的:肿瘤相关成纤维细胞(CAF)是一种与癌症密切相关、高度丰富且异质的间充质成纤维细胞群,它不仅会重构细胞外基质(ECM),还会调节微环境稳态及血管新生。而内皮细胞处于间质与肿瘤之间,在调控细胞间信号传递和呈递血管组织的抗原表位到免疫系统等方面发挥关键的作用。以往的肿瘤治疗研究主要集中在实体瘤上,对肿瘤局部微环境中不同基质细胞间的信息交流关注甚少。揭示CAF、人静脉血管内皮细胞(HUVEC)细胞间的信号传导机制,为抑制肿瘤转移提供新的研究思路。方法:首先构建Lewis肺癌(LLC)皮下移植瘤模型,然后利用酶解法分离CAF与肺正常成纤维细胞(NF),并利用流式细胞术、Western Blotting、免疫荧光等实验来鉴定细胞纯度;利用胶收缩、Western Blotting实验检测CAF对ECM重构及纤维化微环境的影响;比较CAF、HUVEC、LLC三种细胞共培养和CAF、LLC共培养对LLC细胞转移及增殖的影响。利用CCK-8、细胞克隆形成实验来确定最佳的条件培养基(CM)收集时间;通过Transwell、细胞划痕和2D血管形成实验检测CAF对HUVEC细胞富集及血管新生的调节作用,并利用Western Blotting、Real-Time PCR(RT-PCR)检测CAF中血管相关因子和共培养后HUVEC中整合素、基质膜和内质网应激等相关蛋白的表达水平;进一步探究CAF对内皮细胞中AKT/MAPK信号通路活化的影响,然后将血管内皮生长因子A(VEGFA)、整合素β1的干扰RNA分别瞬时转染CAF、HUVEC细胞,探究VEGFA、整合素β1的相互作用及其对AKT信号通路活化的影响。最后添加外源因子或抑制剂到CAF、HUVEC共培养系统中,通过细胞侵袭实验和AnnexinV-FITC/PI双染法检测不同CM对HUVEC细胞侵袭及凋亡的影响。结果:1.成功分离及鉴定CAF、NF。利用流式细胞术分别检测第3代的CAF、NF细胞纯度,其中呈α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)阳性的细胞分别占总细胞的98.3%和85.7%。免疫荧光实验结果表明,几乎所有CAF、NF都表达其蛋白标志物α-SMA,并且位于细胞膜上。我们进一步利用Western Blotting实验进行验证,发现α-SMA和Vimentin蛋白的表达水平在CAF中明显高于NF,其P值分别为0.0210和0.0328。2.胶收缩和Western Blotting实验结果表明,CAF明显促进ECM的收缩,其收缩率与CAF细胞密度成正相关,最大收缩率达60%左右。基质金属蛋白酶2(MMP2)、MMP9、N-钙粘蛋白在CAF细胞中的表达明显升高,而组织金属蛋白酶抑制子3(TIMP3)表达显著降低,其中MMP2/TIMP3、MMP9/TIMP3的比值都明显增大。这些实验结果表明CAF明显促进ECM的重构和形成纤维化的微环境。3.细胞划痕、Transwell、CCK-8和细胞周期等实验结果表明,CAF、LLC共培养不仅明显增强LLC的伤口愈合和迁移能力,还明显提高其细胞活性及细胞分裂能力。相对于CAF、LLC共培养,CAF、LLC、HUVEC三种细胞共培养更明显地促进LLC的迁移和增殖,其P值分别为0.0328和0.0595。4.CAF、HUVEC共培养,极显著地加快HUVEC的伤口愈合,也明显促进细胞的富集,其P值为0.0031;除此之外,CAF或经LLC共培养的NF与HUVEC共培养能明显促进血管新生,其P值分别为0.0026和0.0111,具有显著性差异。5.CAF、HUVEC共培养显著上调内皮细胞中整合素β1、血小板衍生因子β(PDGFβ)和N-钙粘蛋白的表达,其P值分别为:0.0022、0.0068和0.0103;而降低TIMP3与基质膜相关蛋白Laminin的表达,同时引起内质网应激的发生。6.Western Blotting实验结果表明,CAF、HUVEC共培养激活了内皮细胞中AKT/MAPK信号通路。虽然AKT、MAPK总蛋白的表达几乎不变,而磷酸化AKT、MAPK蛋白的表达发生明显上调,其P值分别为0.0419、0.0021。分别用VEGFA和整合素β1的干扰RNA瞬时转染CAF、HUVEC,结果发现VEGFA与整合素β1存在相互作用,并降低HUVEC中p-AKT和TIMP3蛋白的表达。7.相对于对照组,CAF明显抑制HUVEC的细胞凋亡,其P值为0.0082,而促进HUVEC的细胞侵袭。虽然在CAF、HUVEC共培养系统中加入bFGF和TIMP3抑制剂能明显增强HUVEC的细胞侵袭能力,但加入TIMP3抑制剂对HUVEC细胞凋亡影响不大。结论:相对于CAF、LLC共培养,CAF、HUVEC、LLC三种细胞共培养更明显地促进LLC的迁移和增殖。CAF明显促进HUVEC的细胞迁移、增殖、血管新生及抑制其细胞凋亡,并且经LLC共培养的NF也具有类似CAF的部分功能。CAF不仅能明显重构ECM,其异常分泌的VEGFA、MMP2、MMP9和TIMP3等蛋白还能促进血管新生及形成纤维化微环境。除此之外,CAF、HUVEC共培养激活了内皮细胞中AKT/MAPK信号通路,引起PDGFβ、TIMP3、整合素β1等蛋白异常表达。我们进一步发现VEGFA与内皮细胞的整合素β1存在相互作用,然后调节HUVEC中AKT信号通路的活化并同时下调TIMP3蛋白的表达。这一发现,为临床上针对肺癌的治疗或药物筛选提供新的思路。