猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype2,S.suis2)是一种人畜共患的革兰氏阳性病原菌。1998年和2005年我国江苏省和四川省分别暴发大规模S.suis2感染疫情,据中国CDC官方统计数据显示,2005年S.suis2疫情导致人感染病例共计204例,死亡38例;1998年人感染S.suis2病例共计25例,死亡14例(1998年)。病人中出现高比例的、国内外罕见的链球菌中毒性休克综合征(streptococcal toxicshock syndrome,STSS),呈现高侵袭、深部组织感染的特点,病情凶险,病死率高(62.70％～81.3%),引发严重的公共卫生事件。因此在猪链球菌2型中的一些重要蛋白的研究,已成为国内外相关领域许多学者的共同选择。　　 在自然界中几乎有三分之一的蛋白质是依赖于特定金属的金属蛋白,二价金属离子是细菌体内所必需的一类属于过渡族的微量元素,在众多的生物学过程中发挥着极为关键的作用。它们在参与呼吸链、DNA复制、代谢等生理过程的一系列金属蛋白酶中,充当着结构组分或扮演辅因子的重要角色。锰离子和锌离子对猪链球菌的生长和繁殖是必需的,从基因组范围里筛查我们发现S.suis2基因组编码两种二价金属离子转运蛋白,本研究中我们选取其中的TroA蛋白(SsTroA)作为研究对象,通过对其结构和功能进行初步研究,目的在于揭示TroA蛋白的作用机理,从而为猪链球菌病的防治提供一种新途径。实验内容和结果主要包括以下几个方面:　　 TroA蛋白是ABC转运蛋白Al家族的一个成员,生物信息学方法分析表明它与Treponema pallidum的TroA蛋白有最相近的亲缘关系,它很可能结合锌离子和锰离子。Gel filtration以及超速离心分析法证明TroA蛋白在溶液状态下以单体和二聚体混杂的方式存在。进而我们得到了该蛋白2.6(A)以及结合有锌离子的X-衍射晶体数据,并在功能上鉴定了该蛋白。晶体结构分析和序列比对显示,His76。His139,His205以及Asp289构成了锌离子结合的位点。与家族里其他蛋白相比较,猪链球菌的TroA蛋白多出了两段loop区,我们猜测可能在识别离子或者传递底物时发挥生物学功能。　　 ICP-MS实验证实SsTroA重组蛋白中主要含有锌离子还有非常少量的锰离子,这也证明了SsTroA可以结合锌离子和锰离子的假设。进一步对SsTroA和锌离子/锰离子的相互作用进行热力学反应检测发现SsTroA蛋白与这两种金属离子的亲和力都在nmol级别,锰离子的亲和力比锌离子的亲和力略高一点。如此高的亲和力使得SsTroA可以从环境中吸收非常微量的游离金属离子提供细菌正常的生长需求。电子顺磁实验结果明确显示锰离子可以与SsTroA蛋白紧密的结合,从而使电子顺磁的共振波谱发生了一些化学位移以及波峰强度的部分丧失。尽管同家族的蛋白与金属离子的研究已经非常详细,不同的金属离子是否与转运蛋白结合在同一个位点仍然是争议的科学问题。应用核磁共振方法我们对SsTroA蛋白与锌离子/锰离子的相互作用进行了详细的分析,从中我们得出锌离子/锰离子与SsTroA蛋白结合在同一临近区域甚至是同一个位点。　　 为了探索在生理条件下SsTroA蛋白的具体功能,我们尝试对troA基因进行敲除。我们选择两种不同的基因敲除质粒对troA基因进行同源重组实验,但是很可惜无论如何都没能拿到基因缺失株,突变实验造成致死突变或是回复突变。我们猜测troA基因在猪链球菌中可能具有非常重要的功能,突变会造成菌株致死的实验结果,因此troA基因很可能是猪链球菌的一个必需基因。　　 猪链球菌到目前为止还没有出现有效的疫苗,越来越多的研究表明,许多定位细菌表面的ABC transporter具有非常强的免疫原性和免疫保护作用。我们对TroA蛋白在细胞内的定位以及免疫保护作用进行了初步的分析。免疫胶体金实验结果证明TroA蛋白是表达在猪链球菌细胞表面的一种蛋白,与生物信息学分析的结果相符。在小鼠和兔子的血清中都能检测要TroA蛋白的抗体,说明TroA蛋白具有很好的免疫原性。小鼠攻毒实验也向我们展示了TroA蛋白非常有效的抗原保护作用。　　 综上所述,本研究为了探寻TroA蛋白在S.suis2中国强致病株中的结构和功能。通过晶体学方法、ITC、EPR、NMR等技术描述了其三维结构以及与金属离子底物之间的相互作用;基因敲除实验从反向来说明troA基因可能是一个必需基因;动物实验结果显示,TroA蛋白具有很强的免疫原性和抗原保护性。本文研究结果不仅从结构上证实了TroA蛋白结合金属离子的特性,从功能上也描述了其与底物的作用时的各种反应参数,同时我们的研究结果对于开发源自猪链球菌表面蛋白的疫苗也具有积极的促进作用。