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巴伦西亚橘烯和园柚酮是倍半萜家族的萜类化合物,由3分子异戊二烯聚合而成,其中圆柚酮是巴伦西亚橘烯的氧化产物。它们都具有强且持久的柑橘果香,在较低稀释度时呈现典型的柚子香气,可以作为香精添加在食品和化妆品中,具备很大的商业应用价值。除此之外,圆柚酮及其衍生物还有抑制癌细胞增殖、抗血小板凝集、激活能量代谢等生理活性,因此也是潜在的药物前体分子。目前通过天然提取或者化学合成巴伦西亚橘烯和圆柚酮的效率较低,限制了它们的商业化应用。本论文探索利用合成生物学策略,实现其异源生物合成,从而为它们的规模化生产与商业应用奠定基础。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)自身存在甲羟酸(mevalonic acid,MVA)途径,可合成萜类物质的前体法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate,FPP),这为利用代谢工程改造酿酒酵母代谢途径以合成圆柚酮提供了一个很好的操作平台。我们首先在酿酒酵母W303-1A中异源表达了阿拉斯加香柏树来源的巴伦西亚橘烯合酶(Callitropsis nootkatensis valencene synthetase,CnVS),并在重组菌株中检测到了巴伦西亚橘烯的合成,产量为11.6 mg/L。为了进一步提高巴伦西亚橘烯的产量,我们将CnVS与法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthetase,FPPS)进行融合表达,以增强上游产物到下游催化酶分子的传递效率;同时我们过表达了可以解除反馈抑制的甲羟戊酸途径中限速酶-羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶HMGR的截短形式tHMG1,以提升前体FPP的供应,由此使巴伦西亚橘烯的产量提升至156.95 mg/L。进一步利用可对培养基中葡萄糖响应的HXT1启动子调控编码角鲨烯合酶的ERG9,该启动子在低葡萄糖浓度下,起始转录的能力较低,可以减少菌体生长后期麦角固醇途径对前体FPP的消耗,并由此使巴伦西亚橘烯的产量提高至217.95 mg/L。在此基础上,我们分别在巴伦西亚橘烯高产菌株中表达紫孢侧耳菇(Pleurotus sapidu)来源的脂肪氧化酶(lipoxygenase,LOX1)以及天仙子(Hyoscyamus muticus)来源的细胞色素氧化酶HPO(CYP71D55),以催化巴伦西亚橘烯经由圆柚醇合成圆柚酮。研究结果表明,表达HPO的菌株中可检测到圆柚醇和圆柚酮的产生,圆柚酮的产量为9.66 mg/L,而LOX1的表达并不能介导相关产物的合成转化。为了促进圆柚醇向圆柚酮的转化,我们在产圆柚酮的菌株中进一步表达不同来源的醇脱氢酶,包括来源于酿酒酵母的ADH2、ADH6,来源于毕赤酵母(Piahia pastoris)的ADH-C3,来源于姜科植物的ZND以及来源于芸香科柑橘属植物的CND。研究结果显示,ADH-C3、ZND和CND都可成功地催化圆柚醇生成圆柚酮,使圆柚酮产量最高提高五倍,达到59.78 mg/L。综上所述,本论文以酿酒酵母为底盘细胞,将巴伦西亚橘烯合酶与巴伦西亚橘烯氧化酶的异源表达与甲羟戊酸途径改造相结合,在酵母中构建了圆柚酮合成途径,摇瓶发酵圆柚酮产量为59.78 mg/L。研究还首次发现了来自姜科植物的短链脱氢酶ZND与来自芸香科柑橘属植物的短链脱氢酶CND能够催化圆柚醇向圆柚酮的转化,为实现巴伦西亚橘烯和圆柚酮的高效生物合成奠定了良好的基础。