前言:　　 血管瘤是婴幼儿最常见的良性肿瘤之一，是一种血管生成性疾病，主要病理表现是血管过度形成，随后自发性血管退化，其生长过程中存在明显的快速增生期和退化期。血管瘤通常在出生后1个月内出现，之后可有8-12个月的增生期，然后是缓慢的消退期。血管瘤确切发病机制到目前为止仍然尚不明确。对于面积大、生长快的血管瘤，尤其是位于特殊部位、易破溃、感染、毁容、破坏器官结构和功能以及凝血机能障碍者是临床治疗的难题，为预防及减少并发症发生应积极妥善治疗。目前血管瘤的治疗方法很多，但是没有一种治疗方法对所有血管瘤有效，而且治疗本身也可能引起一些严重的并发症。因此，找到一种有效、安全治疗血管瘤的方法一直是科研工作者和临床医生们孜孜不倦奋斗的目标。　　 2008年，法国Bordeaux儿童医院的Léauté-Labréze等人发现，在使用普萘洛尔治疗1例伴肥厚梗阻性心肌病和1例心输出量增加患儿（皆患颜面部血管瘤）时，意外发现血管瘤体表面颜色变浅（深红变为暗红），质地变软，范围缩小。自此以后，国内外有大量关于普萘洛尔治疗血管瘤的报告，普萘洛尔治疗血管瘤从偶然发现到有望迅速成为部分血管瘤治疗的一线药物。然而到目前为止，普萘洛尔究竟是通过何种机制治疗婴幼儿血管瘤仍然没有一个普遍接受的观点。因此有必要对普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤的作用机制进行进一步的实验研究。　　 有大量研究文献表明血管瘤的发生和消退与促血管生成因子VEGF、MMP-9以及细胞凋亡因子caspase-3有关。另有文献报道VEGF、MMP-9和caspase-3的表达可能受β-肾上腺素受体的调控:β-肾上腺素受体的激活在体外实验中能诱导细胞内VEGF和MMP-9的表达增强;而β肾上腺素受体阻滞剂药物也能够在体外影响肿瘤细胞内caspase-3表达。普萘洛尔是一种非选择性β肾上腺素受体阻滞剂，以相同的亲和力完全性抑制β1和β2肾上腺素受体。目前尚缺乏对β-肾上腺素受体(β1和β2)、VEGF、MMP-9和caspase-3在不同时期血管瘤中的表达意义及其相关性研究。结合β-肾上腺素受体阻滞剂普萘洛尔对婴幼儿血管瘤的良好疗效给我们的启示，我们推测是否β-肾上腺素受体（β1和β2）、VEGF、MMP-9和caspase-3在婴幼儿血管瘤的病理发生发展中起到了重要的调控作用，有必要对其进行实验研究。　　 目前国内外对血管瘤患儿体内血清标志物的研究比较多。有文献报道增殖期血管瘤患儿血清中促血管生成因子VEGF含量明显高于消退期血管瘤和正常儿童的血清水平。一氧化氮(NO)的合成与释放与肿瘤血管生成关系十分密切。而eNOS（内皮型一氧化氮合成酶）是内皮细胞中一氧化氮合成与释放的关键调控因子，并调控血管的舒缩效应。有文献表明，VEGF和eNOS在增殖期血管瘤中的表达要明显高于退化期血管瘤和正常皮肤组织中的表达水平，可见VEGF和eNOS在血管瘤的病理发生过程中发挥了重要作用。结合普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤的良好疗效（瘤体缩小，表面颜色变浅），我们推测是否普萘洛尔通过影响血管瘤患儿血清中的VEGF和eNOS的表达水平从而达到治疗婴幼儿血管瘤的效果呢？有必要对口服普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤过程中患儿体内血清中VEGF和eNOS的表达水平进行定期检测实验，以期初步阐明普萘洛尔对婴幼儿血管瘤患儿体内血清学标志物的影响。　　 根据文献推测普萘洛尔治疗血管瘤的疗效机制可能与阻断血管形成的相关信号通路有关，而与血管瘤密切相关最重要的信号通路之一就是VEGF信号转导通路。文献报道VEGF与其受体VEGFR(KDR)结合后引发细胞内一系列信号转导通路:(1) PI3K/AKT;(2) Ras/MAPK;(3) NOS;(4) PKC;(5) FAK/Paxillin。以上信号转导通路导致了血管内皮细胞增殖、细胞存活、细胞迁移、细胞骨架重排、血管渗透等过程。文献报道磷酸化ERK、Akt、mTOR、FAK在增殖期血管瘤的表达明显高于消退期和正常皮肤组织中的表达，表明以上信号分子可能是血管瘤增生的主要活化信号。因此我们推测普萘洛尔是否通过抑制血管内皮细胞的增殖、迁移、侵袭、粘附、成血管能力并促进细胞凋亡，同时抑制与血管瘤增生活化密切相关的ERK、Akt、mTOR、FAK的基因和蛋白的表达，从而达到有效治疗婴幼儿血管瘤的效果。　　 材料和方法:　　 1、样本的收集　　 收集中国医科大学盛京医院病理科2010-2012年皮肤血管瘤存档蜡块52例，另取血管瘤周围正常皮肤组织10例作为正常对照;收集2011年5月-2012年5月中国医科大学口腔医学院口腔颌面外科病区住院增殖期血管瘤患儿35例，男性11例，女性24例。分别在婴幼儿血管瘤患儿口服普萘洛尔治疗前、口服药物后1个月、口服药物后2个月取静脉血2mL，离心并吸取血清分装放入-70℃冰箱内保存备用，避免反复冻融;入脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)购自上海博慧斯生物医药科技有限公司（中美合资）。　　 2、HE染色和免疫组织化学染色　　 按照Mulliken分类标准并结合HE染色和PCNA表达情况进行分组:增殖期血管瘤32例，退化期血管瘤20例。采用免疫组化法检测PCNA、β-肾上腺素受体(β1和β2)、VEGF、MMP-9和caspase-3在不同时期血管瘤中的表达。采用显微图像分析系统Metamorph/Evolution MP5.0/BX51(US/JP，UIC/Olympus)计算β1-AR、β2-AR、VEGF、MMP-9和caspase-3在不同时期血管瘤中表达的平均阳性面积率和平均积分光密度，Pearson相关性分析检测β1-AR、β2-AR、VEGF、MMP-9和caspase-3在增殖期血管瘤中表达的平均阳性面积率的相关性。　　 3、酶联免疫吸附实验　　 采用酶联免疫吸附(ELISA)方法检测增殖期血管瘤患儿口服普萘洛尔治疗前、治疗后1个月，治疗后2个月血清中VEGF、eNOS水平变化。　　 4、细胞培养　　 细胞培养于含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，细胞贴壁生长。实验均选用对数生长期细胞进行加药处理。　　 5、CCK-8法　　 采用CCK-8法检测不同浓度普萘洛尔(0μmol/L、30μmol/L、60μmol/L、90μmol/L、120μmol/L)对人脐静脉内皮细胞HUVEC培养24h和48h增殖能力的影响。　　 6、划痕实验　　 采用划痕实验检测不同浓度普萘洛尔(0μmol/L、30μmol/L、60μmol/L、90μmol/L、120μmol/L、200μmol/L)在同时加入或者不加入20ng/mL VEGF的情况下对HUVEC体外迁移能力的影响。　　 7、Annexin V-FITC/PI双染色法　　 采用Annexin V-FITC/PI双染色法流式细胞仪检测不同浓度普萘洛尔(0μmol/L、30μmol/L、60μmol/L、90μmol/L、120μmol/L)对HUVEC细胞处理24h和48h后早期凋亡率的影响。　　 8、Transwell小室法　　 采用Transwell小室法检测不同浓度普萘洛尔(0μmol/L、30μmol/L、60μmol/L、90μmol/L、120μmol/L、200μmol/L)对HUVEC侵袭能力的影响。　　 9、细胞粘附实验　　 采用细胞粘附实验检测不同浓度普萘洛尔(0μmol/L、30μmol/L、60μmol/L、90μmol/L、120μmol/L、200μmol/L)对HUVEC粘附能力的影响。　　 10、成管实验　　 采用成管实验(Tube formation assay)检测不同浓度普萘洛尔(0μmol/L、30μmol/L、60μmol/L、90μmol/L、120μmol/L、200μmol/L)在同时加入或者不加入50ng/mL VEGF的情况下对HUVEC成管能力的影响。　　 11、RT-PCR实验　　 采用RT-PCR法检测不同浓度普萘洛尔(0μmol/L、30μmol/L、60μmol/L、90μmol/L、120μmol/L、200μmol/l)对VEGF诱导的HUVEC中血管生成信号通路分子ERK、Akt、mTOR、FAK mRNA的影响。　　 12、Western blot实验　　 采用Western blot法检测不同浓度普萘洛尔(0μmol/L、30μmol/L、60μmol/L、90μmol/L、120μmol/L、200μmol/L)对VEGF诱导的HUVEC中血管生成信号通路相关蛋白ERK、Akt、mTOR、FAK表达的影响。　　 结果:　　 1、β1-AR和β2-AR在增生期和退化期血管瘤组织中的表达显著高于正常皮肤组织中的表达(P＜0.01)。VEGF和MMP-9在增殖期血管瘤中的表达显著高于退化期血管瘤和正常皮肤组织中的表达(P＜0.01); Caspase-3在退化期血管瘤中的表达显著高于增殖期血管瘤和正常皮肤组织中的表达(P＜0.01)。增殖期β1-AR和β2-AR表达的平均阳性面积率与VEGF和MMP-9表达的平均阳性面积率呈现明显的正相关性(P＜0.01);增殖期caspase-3表达的平均阳性面积率与β1-AR，β2-AR，VEGF和MMP-9表达的平均阳性面积率呈显著负相关性(P＜0.01)。　　 2、口服普萘洛尔用药前和用药2个月后血清VEGF和eNOS浓度相比差异具有统计学意义（P＜0.01）;口服普萘洛尔用药前和用药一个月后血清VEGF和eNOS浓度相比无统计学差异(P＞0.05)。　　 3、CCK-8实验结果显示在加药处理24h和48h后，30μmol/L、60μmol/L、90μmol/L、120μmol/L与正常对照组相比，普萘洛尔对HUVEC细胞的增殖能力的抑制率呈上升趋势(60μmol/L、90μmol/L、120μmol/L普萘洛尔组与正常对照组相比，P＜0.01)。　　 4、划痕实验结果显示在阴性对照组和单纯加入普萘洛尔处理组中，普萘洛尔呈浓度依赖性抑制HUVEC细胞迁移运动(P＜0.01);在加入VEGF诱导和普萘洛尔处理组以及阳性对照组中，普萘洛尔呈浓度依赖性抑制HUVEC细胞迁移运动(P＜0.01)。　　 5、Annexin V-FITC/PI双染色法流式细胞仪检测结果显示在加入不同浓度普萘洛尔处理组和对照组培养24小时之后，HUVEC细胞的早期凋亡率逐渐增加(6.55％、8％、12.57％、13.79％、20.3％);在加入不同浓度普萘洛尔处理组和对照组培养48小时之后，HUVEC细胞的早期凋亡率逐渐增加(7％、11.8％、12.65％、15.2％、30.8％)。　　 6、Transwell实验结果显示随着普萘洛尔浓度的不断增大，HUVEC侵袭能力逐渐减弱，迁移至微孔膜下层的细胞数目逐渐减少，30、60、90、120、200μmol/L普萘洛尔处理组细胞侵袭个数与正常对照组相比均具有显著统计学差异(P＜0.01)。　　 7、细胞粘附实验结果显示随着普萘洛尔浓度的不断增大(0、30、60、90、120、200μmol/L)，HUVEC粘附能力逐渐减弱，30、60、90、120、200μmol/L普萘洛尔处理组细胞粘附能力检测595nm吸光度值与正常对照组相比均具有显著统计学差异(P＜0.01)。　　 8、成管实验结果显示不同浓度普萘洛尔处理组细胞成管个数与阴性对照组HUVEC成管个数相比均具有显著统计学差异(P＜0.01);不同浓度普萘洛尔+50ng/mL VEGF处理组细胞成管个数与阳性对照组HUVEC成管个数相比均具有显著统计学差异(P＜0.01)。　　 9、RT-PCR实验结果显示随着普萘洛尔浓度的不断增大(0、30、60、90、120、200μmol/L)，对VEGF诱导的HUVEC中血管生成相关信号分子Akt、mTOR、Erk、FAK mRNA的表达呈浓度依赖性抑制作用。　　 10、Western blot实验结果显示随着普萘洛尔浓度的不断增大(0、30、60、90、120、200μmol/L)，对VEGF诱导的HUVEC血管生成相关信号分子Akt、mTOR、Erk、FAK的磷酸化蛋白表达呈浓度依赖性抑制作用，而对以上各个信号分子的总蛋白表达并没有影响。　　 结论:　　 1、β1-AR、β2-AR、VEGF、MMP-9和caspase-3在婴幼儿血管瘤的增生和消退过程起到了重要的调控作用;β-肾上腺素受体阻滞剂普萘洛尔可能是通过调控β-AR/VEGF/MMP-9/caspase-3通路，抑制血管瘤内皮细胞VEGF、MMP-9的表达，激活caspase-3，促进血管瘤的凋亡，并最终导致血管瘤的消退。　　 2、普萘洛尔治疗增殖期血管瘤的作用机制之一可能是通过减少血清中VEGF、eNOS浓度进而抑制血管瘤中的血管生成，并导致血管收缩效应，使瘤体缩小。　　 3、普萘洛尔治疗增殖期血管瘤的作用机制之一可能是通过阻断VEGF介导的血管生成信号通路，抑制其下游信号分子的表达，从而达到抑制血管瘤内皮细胞的增殖、迁移、侵袭、粘附以及血管生成能力，并促进血管瘤内皮细胞的凋亡，最终达到血管瘤体消退的治疗效果。