背景和目的神经胶质瘤是最常见的原发性恶性脑肿瘤,具有恶性增值、血管生成和侵袭周围正常脑组织的特征。尽管经过积极的手术、放疗和化疗治疗,胶母细胞瘤患者的中位存活期仅仅有12-15个月。肿瘤侵袭是肿瘤治疗失败的主要原因。为延长患者生存期,提高患者生存质量,迫切需要新的临床生物标记和治疗靶点,从而提出抑制或减少肿瘤细胞侵袭能力的新治疗方案。MicroRNAs(miRNAs)是一类参与调控不同生物过程的异常非编码RNA(长度大约为22个核苷酸)。通过使用实时定量PCR发现microRNA-132(mi R-132)在胶质瘤组织中显著异常表达。基于miR-132靶基因的假设,我们预测miR-132和基质金属蛋白酶(MMP)家族中的一种蛋白MMP-16(MT-MP3)有着显著关联。在人源胶质瘤细胞株A172,SHG44和U87中过表达miR-132可以抑制细胞侵袭和转移。而且在A172,SHG44和U87细胞中通过使miR-132的过表达从而减少了MMP-16的表达。总结以上结果分析:miR-132通过MMP-16影响胶质瘤细胞侵袭和转移,并且在胶质瘤中miR-132作为一类抑制转移相关基因的miRNA而存在。MicroRNAs(mi RNAs)是较短的单链核苷酸RNA分子,通过结合它们靶基因的mRNA分子的3’非编码区来调控基因表达,从而抑制基因转录或诱导mRNA降解。miRNAs控制细胞生长、增殖、新陈代谢和凋亡。事实上,特殊类型的miRNA失调已经被证明与特定类型的肿瘤相关联。例如,miR-16在胶质瘤细胞低表达并且抑制Bcl-2表达;在转移性胶质瘤细胞中miR-145过表达,并且抑制ADAM17表达。基质金属蛋白酶16(Matrix metalloprotease 16)是一类膜型金属蛋白酶。作为酶原,通过激活proMMP-2(明胶酶A)活性来起作用。MMP-16是由细胞分泌产生。然而,酶谱显示明胶酶激活活化的MMP-2是激活MMP-16的间接机制。MMP-2可以裂开基底膜上的胶原蛋白IV,参与肿瘤转移过程。毫无疑问,在胃癌、肝细胞癌、前列腺癌和黑色素细胞瘤中mmp-16的高表达与肿瘤细胞侵袭力增加相关联。本研究不仅要探讨mir-132在非瘤脑组织、不同级别的人脑胶质瘤组织以及三个恶性胶质瘤细胞系(a172,shg44和u87)中的表达,而且进一步通过体外试验探讨mir-132与人脑胶质瘤细胞侵袭性的相关性。本研究还旨在为未来进一步深入研究mir-132在人类神经胶质瘤中的作用机制奠定基础。一、材料和方法1.通过使用microrna.orgdatabase、thedatabaseonpredicted和publishedmicrornas(mirwalk),我们预测mirna-132(mir-132)与恶性脑肿瘤具有较强关联性。2.化学合成的mir-132寡核苷酸随机序列通过脂质体2000被转染进恶性胶质瘤细胞株a172,shg44和u87中。3.人源胶质瘤细胞株a172,shg44和u87的转染效率通过流式细胞术和绿色荧光检测。4.使用实时定量pcr(qrt-pcr)分别检测非瘤脑组织和人类胶质瘤组织标本中mir-132表达情况。5.使用transwell实验检测mir-132对人源胶质瘤细胞株a172,shg44和u87中的侵袭能力的影响。6.使用westernblot检测mmp-2和mmp-16表达情况。7.荧光素酶报告实验证明mmp-16是mir-132直接靶向基因。8.显示的数据为均值±标准差。使用spss版本12.0windows版本软件。使用方差分析(anova)和student’st-test进行统计分析。经过统计分析p值<0.05。二、结果1.mir-132在胶质瘤组织中的表达低于正常脑组织。本研究中使用实时定量pcr检测mir-132在11例低级别胶质瘤组织、12例高级别胶质瘤组织和8例正常脑组织中的表达情况。其实验结果显示:相对于正常脑组织,mir-132在胶质瘤组织中的表达显著降低;同时与正常脑组织相比,mir-132在胶质瘤细胞株(a172,shg44和u87)中的表达更低。mir-132在胶质瘤组织和胶质瘤细胞株的下调表明mir-132也许是胶质瘤治疗的潜在靶点。2.mir-132抑制胶质瘤细胞的侵袭能力。使用transwell实验检测mir-132对人源胶质瘤细胞株a172,shg44和u87中的侵袭能力的影响。本研究将mir-132模拟物和抑制剂被转染进人源胶质瘤细胞a172、shg44和u87。mir-132模拟物或干扰rna转染后的72小时,a172、shg44和u87被接种于上室,48小时后通过细胞外基质侵入的细胞被拍片和计数。在所有的细胞株中,相对于对照组,mir-132减少了侵入细胞的数量。实验数据表明mir-132是体外实验中细胞侵袭和迁移的调控分子。3.mmp-16mrna在胶质瘤组织的表达。实时荧光定量pcr分析表明:相对于8例正常脑组织,mmp-16mrna在11例低级别和12例高级别胶质瘤组织的表达显著增高。结果发现:mir-132在胶质瘤组织中的表达低于正常脑组织。由此说明在肿瘤组织中mmp-16mrna的表达量较mir-132表达高,表明在肿瘤组织中mmp-16mrna的表达与mir-132的表达呈负相关。4.mir-132下调mmp-16mrna的表达。为了进一步阐明mir-132在胶质瘤细胞中抑制细胞侵袭能力的机制,本研究使用targetscan5andmirbase预测mir-132的靶基因,这些软件显示:mmp-16可能作为mir-132直接靶向调节基因,在肿瘤的细胞转移和侵袭中扮演重要角色。同时运用rt-pcr实验和qrt-pcr实验检测发现:与对照组细胞相比,转染了mir-132模拟物的胶质瘤细胞(a172,shg44和u87)显著降低了mmp-16mrna的表达水平。以上的结果表明:mmp-16可能作为mir-132直接靶向调节基因,从而抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力。5.mir-132直接靶向调节mmp-16基因的表达。本研究运用westernblot分别检测在转染mir-132后a172,shg44和u87中mmp-16蛋白的表达水平,其结果表明:mmp-16的蛋白表达水平在被转染mir-132模拟物和抑制物后分别被下调和上调。进一步通过荧光素酶实验检测发现:mir-132直接抑制了mmp-16基因mrna的3’-utr表达,从而证实mmp-16是mir-132天然靶向调节基因。6.mmp-16作为mmp-2的活化剂激活mmp-2蛋白表达水平。mmp-16是一种膜结合型mmp,能激活mmp-2来增加侵袭能力。mmp-2被mmp-16激活,这是mmp-16功能的间接途径。mir-132被预测靶向作用mmp-16(mt3-mmp,membranetype3mmp)(www.microrna.org)。westernblot和荧光素酶实验被用来验证这一假设。结果表明:miR-132通过调节MMP-16的表达从而影响MMP-2蛋白的表达;miR-132的过度表达通过下调MMP-16的表达,从而抑制人类胶质瘤细胞(A172,SHG44和U87)的侵袭能力。三、结论Has-mi R-132基因是位于17号染色体(1953202-1953302),长为100bp的碱基对。在过去的几年里,许多研究发现miR-132异常表达参与了不同肿瘤的发生、发展过程。例如:miR-132作为肿瘤抑制器在乳腺癌中抑制细胞增殖。而且,miR-132异常表达在原发性骨肉瘤,阿尔兹海默病、前列腺癌和胰腺癌中被发现。然而,mi R-132在胶质瘤细胞迁移和侵袭中的作用仍有待探索。本研究发现miR-132的表达水平在胶质瘤组织中低于正常脑组织,而且mi R-132抑制胶质瘤细胞侵袭和迁移能力。被miR-132模拟物转染的胶质瘤细胞(A172,SHG44和U87)减少肿瘤细胞的迁移和侵袭能力,同时用miR-132抑制剂转染上述细胞则产生相反的结果。MMP-16是一种膜结合型MMP,能激活MMP-2来增加侵袭能力。MMP-2被MMP-16激活,这是MMP-16功能的间接途径。目前的研究结果表明了MMP-16与胶质瘤细胞侵袭和迁移能力密切相关。以前的研究结果显示减少的MMP-16的水平有效地抑制胶质瘤细胞的侵袭性。MMP-16同时被发现拥有抗细胞外基质组分的蛋白水解的活性,如III型胶原蛋白。在正常脑组织和星形胶质瘤组织中,MT3-MMP可能参与了细胞外基质更新。本研进一步证实miR-132通过减少基质金属蛋白酶基因MMP-16的表达从而抑制胶质瘤细胞(A172,SHG44和U87)侵袭和迁移能力。总而言之,本研究证实:在恶性胶质瘤细胞中,miR-132可能通过直接调节MMP-16蛋白的表达来影响胶质瘤细胞的迁移和侵袭性中起重要作用;miR-132也许是胶质瘤侵袭和转移的潜在治疗靶点。然而,在体内试验中,MMP-16的活性是否通过miR-132被影响需要更进一步的深入研究来确认。