乳酸菌是一类与人的身体健康密切相连的微生物。随着完成全基因组测序的乳酸菌种类越来越多,功能性基因的研究也越来越重要。CRISPR/Cas9基因编辑技术由于实验简单、操作容易、节省时间等优势,可以精确、高效地对基因组进行敲除或者修饰,已经在不同物种中迅速发展起来并得到广泛应用,但是在乳酸菌中的研究报道不多。葡糖胺-6-磷酸合成酶(Glucosamine-6-phosphate synthase,GlmS)是氨基已糖代谢途径(HBP)的催化酶,终产物是N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)和氨基葡萄糖(GlcN)。本实验室前期研究表明glmS1基因是植物乳杆菌WCFS1编码GlmS的重要基因,glmS1基因缺陷菌在不添加氨基葡糖的培养基中无法生长。本研究将选用glmS1基因作为CRISPR/Cas9基因编辑技术的目的基因,构建并验证植物乳杆菌WCFS1基因编辑系统,为进一步开展更多乳酸菌的功能基因的编辑奠定基础。本研究首先分别成功构建了含Cas9、recT基因的pMT019和含tracrRNA的ptracrRNA两种质粒。随后通过对启动子结构进行优化,确定了含诱导型启动子PSPPQ的pMT023质粒的Cas9基因和recT基因表达量最高,即pMT023质粒诱导1h时Cas9基因相对表达量上调29.58倍,recT基因相对表达量上调2611倍。进而,对WCFS1感受态细胞制备过程进行优化,得出最佳制备条件为OD600=0.3时,加入诱导剂SppIP 30℃诱导 1h。最后利用 MT+GlcNAc(Cm10+Ery10)和 MT(Cm10+Ery10)两种平板进行对比筛选,筛选出的菌株提取全基因组测序。但是,本实验目前尚未筛选到目的突变子。