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背景与目的人类T淋巴细胞白血病病毒(human T-lymphotropic virus,HTLV)是最早发现的人类逆转录病毒,主要包括四种亚型,其中HTLV-1和HTLV-2二者的基因水平70%同源。成人T细胞白血病(adult T-cell leukemia,ATL)和HTLV-1相关性脊髓病/热带痉挛性下肢轻瘫(HTLV-1assoeiated myelopathy/Tropical SPastio paraparesis,HAM/TSP)是主要的HTLV-1感染相关性疾病。HTLV-1和HTLV-2可通过垂直途径，性接触和肠道外途径(血液传播和静脉用药)进行传播,在全球均有流行。HTLV-1主要流行于日本、加勒比地区,中美洲和南美洲及中非西非等地区。HTLV-2流行主要是印第安人群和某些中非部落,以及欧洲和北美的某些特定人群。我国属于HTLV非流行区,自1985年来开展过几次HTLV流行调查,感染率为0.06%-1.27%,流行区域主要分布于东南沿海地区。但对于人口大省的河南和湖北,对HTLV感染及流行的研究报道较少。由于不同地域的病毒株之间存在差异,目前的HTLV-1检测方法均存在一定的假阳性或假阴性问题。HBZ是近年来在HTLV-1感染细胞中发现的一种由基因组负链或互补链编码产生的病毒蛋白,在大部分ATL细胞中成阳性表达,可以抑制Tax介导的病毒基因表达。HBZ还能通过它的bZIP结构域,与宿主的多种bZIP因子相互作用,从而改变下游基因转录活性,被认为在HTLV-1致病机制上起着重要作用。但HBZ在HTLV-1感染细胞中的致瘤作用机制还需进一步探讨。本研究以HBZ病毒蛋白为对象,研究HBZ对293T细胞周期蛋白cyclin D1表达的影响,并以HBZ为基础,初步建立了HTLV-1的ELISA检测方法,最后,对华中地区不同人群中的HTLV1/2感染情况作了流行病学调查。为了解HBZ在细胞周期进程中的作用机制,改进HTLV-1筛查方法,以及了解河南湖北两省HTLV感染流行状况,提供了一定的实验基础和理论依据。第一部分HBZ通过与转录因子CREB相互作用抑制cyclin D1表达方法1.扩增全长HBZ、HBZ-AD以及HBZ-bZIP三个片段,分别克隆入慢病毒载体LV5,包装纯化重组慢病毒；分别将三个慢病毒感染293T细胞,CEM细胞及Jurkat细胞,建立稳定表达HBZ三个片段的细胞系。2. RT-PCR和Western Blot检测293T-HBZ细胞、CEM-HBZ细胞及Jurkat-HBZ细胞中cyclin D1的nRNA水平和蛋白质水平。3.构建cyclin D1启动子全长及包含不同转录因子区域的五个报告基因载体,检测表达不同HBZ片段的细胞中cyclin D1启动子的活性状况。4.提取空白293T细胞及293T-HBZ细胞总蛋白,利用anti-HA抗体进行免疫共沉淀(CoIP),再利用anti-CREB抗体通过Western Blot检测HBZ与CREB司在体内的相互关系。5.构建CREB的原核表达载体pGEX-2T-CREB,利用诱导、表达、纯化获得的融合蛋白GST-CREB与HBZ进行GST pull-down,检测HBZ与CREB司在体外的相互关系。6.构建HBZ-bZIP的原核表达载体pGEX-2T-HBZ-bZIP,利用诱导纯化的GST-HBZ-bZIP融合蛋白进行GST pull-down,检测HBZ-bZIP和HBZ-AD与CREB间在体外的相互关系。结果1.HBZ、HBZ-AD、HBZ-bZIP三个重组慢病毒载体经酶切和测序鉴定正确；三个重组慢病毒感染、筛选得到稳定表达HBZ、HBZ-AD、HBZ-bZIP的细胞株。2. RT-PCR和Western Blot结果均显示,与空白293T细胞相比,293T-HBZ细胞和293T-HBZ-bZIP细胞中cyclin D1基因表达水平显著降低。说明HBZ的bZIP结构域可以降低细胞中cyclin D1转录和表达水平。3.将cyclin D1全长启动子报告基因载体pGL3-CD1转染空白CEM细胞、CEM-HBZ细胞、CEM-HBZ-AD细胞及CEM-HBZ-bZIP细胞后,表达HBZ和HBZ-bZIP的细胞中cyclin D1启动子活性降低。当报告基因载体中启动子片段长度包含CRE位点时(CD2和CD3),细胞中启动子活性无明显下降；而当删除CRE位点后(CD4),空白细胞和HBZ-AD细胞中启动子活性下降约50%,说明CRE位点是cyclin D1启动子上的一个重要转录因子。4.CoIP结果显示,利月anti-HA抗体对293T-HBZ细胞总蛋白进行沉淀获得的复合物中,可以检测到CREB;利用GST-CREB融合蛋白进行GST pull-down实验结果说明CREB和HBZ蛋白在体外可以直接结合。5.进一步GST pull-down实验结果显示,GST-CREB融合蛋白可以与HBZ-bZIP相互结合,而GST-HBZ-bZIP融合蛋白也可以与CREB相互结合；GST-CREB融合蛋白可以与HBZ相互结合,但不与HBZ-AD目互结合。第二部分以HBZ为抗原的HTLV-1ELISA检测方法的初步建立方法1.PCR扩增HBZ目的基因,克隆入T载体,酶切鉴定后,亚克隆入原核表达载体pET-29a,经PCR鉴定、酶切鉴定及测序鉴定后,构建HBZ原核表达载体。2.通过IPTG诱导HBZ蛋白表达,并利用His标签通过Ni2+亲和层析柱纯化蛋白,SDS-PAGE电泳及Western Blot鉴定后,对目的蛋白进一步进行透析纯化。3.以HBZ蛋白为抗原包被酶标板,以亲和素标记的HBZ蛋白为酶标抗原,利用双抗原夹心法检测血清标本中的相应抗体,优化反应条件,建立HTLV-1ELISA检测方法。4.通过对标准血清、临床血清的检测,与其他商品试剂盒的比较,以及稳定性检测,对该ELISA检测方法进行评价。结果1.PCR扩增得到HBZ片段,酶切鉴定及测序鉴定证实得到重组原核表达质粒pET-29a-HBZ。2.通过IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显示25kD处特异性条带；经过Ni2+亲和层析柱对表达蛋白进行纯化后,SDS-PAGE电泳显示25kD处单纯条带；Western Blot结果显示纯化后的HBZ蛋白具有良好的抗原性。3.纯化HBZ蛋白标记生物素后,经亲和素鉴定酶标抗原活性良好；确定使用30μl标本,并采用“三步法”的反应模式检测40min,可获得较好的检测效果。4.对参比血清的检测结果显示该ELISA方法具有较好的检测效果；稳定性检测结果显示该ELISA检测试剂具有较好的稳定性；对临床血清标本的检测,及与国内外商品试剂进行比较的结果显示,该检测法灵敏度和特异性分别为71.6%,96.7%,Kappa值为0.54,有较好的一致性。第三部分华中地区不同人群中的HTLV-1/2流行病学调查方法1.收集2008年-2011年间,河南湖北两省血清标本5480份,包括献血人群(3548份),血液肿瘤患者(908份)和高危人群(1024份)三组。利用北京万泰的HTLV检测试剂盒对标本进行初步筛查,阳性标本再进一步通过Western Blot确证HTLV-1或HTLV-2感染情况。2.对感染状况及高危因素进行单因素方差分析及多元逻辑回归分析。3.对经Western Blot证实的HTLV-1阳性标本提取前病毒基因组,对全长基因组序列进行分段扩增,与T载体连接后送测序,利用生物学软件对序列进行拼接；对HTLV-1前病毒基因组序列进行分析,并利用进化树进行同源性分析。结果1.ELISA检出17例HTLV-1/2抗体阳性标本,经过Western Blot证实,HTLV-1抗体阳性7例,HTLV-2抗体阳性3例。2. HTLV-1和HTLV-2间感染率无差异,但高危人群组较献血源组HTLV-1感染率增加(P=0.03); HTLV-1与HIV、HBV、HCV合并感染较常见(P<0.05)。HTLV-1感染流行与HIV及HBV相关(P=0.006,P=0.000)。3.经过测序和拼接获得HTLV-1全病毒基因组序列(KC807984)；该序列长度为9034bp,属Genotype A,与其他中国病毒株亲缘关系最密切,与日本病毒株及加拿大病毒株亲缘较近。结论1.HBZ可以通过其bZIP结构域,与转录因子CREB相互作用,影响CREB与cyclinD1启动子区域的CRE位点结合,进而抑制下游基因的转录,导致293T细胞中cyclin Dl表达水平降低,为HBZ在细胞周期变化中的作用机制研究提供理论依据。2.初步建立了以HBZ为抗原的HTLV-1ELISA检测方法。3.流行病学调查发现华中地区不同人群中存在HTLV-1/2感染病例,无偿献血人群及血液肿瘤患者中感染率低,高危人群组中HTLV-1/2感染率相对较高,HIV和HBV感染是HTLV-1感染的高危独立因素；测序得到的HTLV-1病毒基因组序列分析显示与国内其他病毒株亲缘关系近,为本地区特定人群进行HTLV-1/2筛查及制定无偿献血标准提供资料依据。