研究目的动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是以动脉壁增厚、变硬和弹性减退为特征的动脉硬化性疾病。目前认为AS的形成过程是一种慢性炎症反应,而血管内皮细胞炎性样损伤是AS发生的始动环节。因此保护血管内皮细胞对于预防和治疗AS及其相关疾病具有重要的临床意义。流行病学和基础研究均表明高同型半胱氨酸血症（hyperhomocyst eine,HHCy）是血管内皮损伤独立的危险因素,HHCy患者常伴有AS的发生。Diplacone是从毛泡桐果中提取的一种天然香叶烯基黄酮类化合物,具有很好的抗炎、抗菌、抗氧化的活性。本课题拟通过建立同型半胱氨酸（homocysteine,HCy）诱导人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）炎性损伤模型,研究Diplacone对HCy诱导血管内皮细胞损伤的保护作用及其机制。研究方法1.HUVEC的培养HUVEC培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中,37℃、5%CO₂培养箱中培养。细胞汇合致80%⁹0%,用含EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化,常规传代。2.HCy诱导血管内皮细胞损伤模型的建立（1）HCy最适损伤浓度的确定。将培养好的HUVEC分为正常对照组（不加HCy）、HCy模型组和基质空白组（无细胞的调零组）,其中HCy模型组又分为0.25 mmol/L HCy组、1 mmol/L HCy组、2 mmol/L HCy组、4 mmol/L HCy组和6 mmol/L HCy组。各HCy模型组分别加入不同浓度的HCy溶液,与正常对照组共同孵育24 h后,同时加入MTT检测细胞存活率,通过作图分析得到最适损伤浓度。（2）HCy最佳损伤时间的确定。将培养好的HUVEC分为正常对照组（不加HCy）、HCy模型组和基质空白组（无细胞的调零组）,其中HCy模型组又分为36 h组、24 h组、12 h组、6 h组、2 h组。各HCy模型组分别在不同时间点加入HCy最适损伤浓度,与正常对照组共同培养至36 h,然后同时加入MTT检测细胞存活率,通过作图分析得到HCy诱导HUVEC产生损伤的最佳时间。3.实验分组将培养的HUVEC分为正常对照组（不加HCy）、2 mmol/L HCy模型组、Diplacone给药预处理组。其中Diplacone预处理给药组设置0.1μmol/L Diplacone+2 mmol/L HCy组、1μmol/L Diplacone+2 mmol/L HCy组、10μmol/L Diplacone+2 mmol HCy组和100μmol/L Diplacone+2 mmol HCy 4个处理组。Diplacone预孵育2 h后,需以2 mmol/L HCy孵育的各组再加入HCy继续孵育12 h。4.血管内皮细胞形态学及细胞凋亡变化的检测方法（1）MTT法检测细胞的存活率,并在倒置显微镜下观察HUVEC的形态变化;（2）Hochest33342细胞核染色法在荧光显微镜下观察凋亡细胞核的形态变化;（3）流式细胞仪检测HUVEC的凋亡率和细胞周期的变化。5.细胞相关活性物质的检测（1）ELISA法检测HUVEC培养液中黏附分子VCAM-1、ICAM-1、P-selectin、E-selectin含量。（2）采用不同试剂盒分别检测HUVEC ROS细胞比率、MDA含量、SOD和GSH-Px活性。（3）Western Bloting法检测黏附分子VCAM-1、ICAM-1、P-selectin、E-selectin,凋亡蛋白Bcl2、Bax、Casepase-9和NF-κB蛋白表达水平的变化。（4）qRT-PCR法检测黏附分子VCAM-1、ICAM-1、P-selectin、E-selectin,凋亡基因Bcl2、Bax、Casepase-3、P53和NF-κB mRNA表达水平的变化。实验结果1.复苏过程中HUVEC细胞形态学变化采用倒置显微镜观察复苏后的细胞,呈圆形透明状个体,悬浮于细胞培养液中,培养24 h后,细胞基本贴壁,细胞形状呈短梭形,颜色透明。随培养时间的增加,细胞数量也在持续增多,细胞呈短梭形或多角形,单层铺路石状镶嵌排列。2.HCy最适损伤浓度和时间的确定采用不同浓度的HCy孵育HUVEC 24 h,作图分析比较后得到最适损伤浓度为2mmol/L。将最适损伤浓度2 mmol/L HCy在不同时间点加入到处理好的HUVEC中,作图分析比较后得到HCy诱导HUVEC产生损伤的最佳时间为12 h。3.Diplacone对HCy诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用（1）对细胞存活率的影响与正常对照组比较,HCy模型组存活率显著降低（P<0.01）。与HCy模型组比较,0.1μmol/L Diplacone组细胞存活率虽无明显统计学差异,但有升高趋势;1μmol/L和10μmol/L Diplacone组的细胞存活率均显著增加（P<0.01）;100μmol/L Diplacone组则无明显变化。提示0.1μmol/L¹0μmol/L Diplacone可呈浓度依赖性抑制HCy对HUVEC的损伤,增加细胞存活率。（2）对细胞形态的影响在显微镜下观察细胞形态,与正常对照组比较,HCy模型组细胞体积皱缩,形态趋于细长,形状不规则,部分脱落。与HCy模型组比较,0.1μmol/L¹0μmol/L Diplacone组细胞形态呈浓度依赖性的逐渐改善,逐渐趋于饱满,且脱落数量逐渐减少;100μmol/L Diplacone组细胞则无明显变化。（3）对细胞核凋亡形态的影响荧光显微镜下观察可知,与正常对照组比较,HCy模型组细胞核呈明显的凋亡形态特点,胞核多数呈亮蓝色荧光,染色体凝集、边聚化。与HCy模型组比较,0.1μmol/L¹0μmol/L Diplacone组呈凋亡形态特点的细胞核呈浓度依赖性的显著减少,呈均匀蓝色荧光的细胞核数目逐渐增多,染色体凝集、边聚化程度降低;100μmol/L Diplacone组细胞则无明显变化。（4）对细胞凋亡率的影响与正常对照组比较,HCy模型组细胞凋亡率明显增加（P<0.05）。与HCy模型组比较,0.1μmol/L Diplacone组细胞凋亡率无明显变化,但有降低趋势,1μmol/L和10μmol/L Diplacone组细胞凋亡率均显著降低（P<0.05）,100μmol/L Diplacone组则无明显变化。提示0.1¹0μmol/L Diplacone可呈浓度依赖性的降低HCy诱导的细胞凋亡。（5）对细胞周期的影响与正常对照组比较,HCy模型组细胞周期G₀/G₁的细胞比重显著增加（P<0.05）,S期的细胞比重显著降低（P<0.05）。与HCy模型组比较,0.1μmol/L Diplacone组和1μmol/L Diplacone组细胞周期虽无明显变化,但G₀/G₁的细胞比重有降低趋势,S期的细胞比重有增加趋势,10μmol/L Diplacon组细胞周期G₀/G₁期的比重显著降低（P<0.05）,S期的细胞比重显著增加（P<0.05）,100μmol/L Diplacone组则无明显变化。提示0.1μmol/L¹0μmol/L Diplacone可呈浓度依赖性解除HCy阻断周期的作用。4.Diplacone对同型半胱氨酸诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用机制（1）Diplacone对HCy诱导的HUVEC的VCAM-1、ICAM-1、P-selectin、E-selectin含量,蛋白和mRNA表达水平的影响ELISA、Western Bloting和qRT-PCR检测结果显示,与正常对照组比较,HCy模型组的VCAM-1、ICAM-1、P-selectin、E-selectin的含量、蛋白和mRNA的表达水平均显著升高（P<0.05）。与HCy模型组比较,10μmol/L Diplacone组的VCAM-1、ICAM-1、P-selectin含量显著降低（P<0.05）,0.1μmol/L、1μmol/L和100μmol/L Diplacone组则均无明显变化;1μmol/L和10μmol/L Diplacone组VCAM-1、ICAM-1、P-selectin的基因和蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）,0.1μmol/L和100μmol/L Diplacone组则均无明显变化;0.1μmol/L Diplacone¹00μmol/L Diplacone组E-selectin均无统计学意义。（2）Diplacone对HCy诱导的HUVEC氧化应激指标ROS、SOD、GSH-Px和MDA的影响试剂盒检测结果显示,与正常对照组比较,HCy模型组的ROS细胞比率以及MDA的含量均显著升高（P<0.05）,抗氧化指标SOD、GSH-Px的活性显著降低（P<0.05）。与HCy模型组比较,1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L Diplacone组的ROS细胞比率均显著降低（P<0.05）,GSH-Px活性均显著升高（P<0.05）,0.1μmol/L Diplacone组则均无明显变化;0.1μmol/L¹0μmol/L Diplacone组的SOD的活性呈浓度依赖性显著升高（P<0.05）,100μmol/L Diplacone组则均无明显变化;0.1μmol/L¹00μmol/L Diplacone组的MDA的含量均显著降低（P<0.05）。（3）Diplacone对HCy诱导的HUVEC Bax、Bcl2和Casepase-9蛋白表达水平的影响Western Bloting检测结果显示,与正常对照组比较,HCy模型组促凋亡指标Bax、Casepase-9蛋白表达水平均显著升高,抑制凋亡指标Bcl2的蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。与HCy模型组比较,1μmol/L和10μmol/L Diplacone组的Bax蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）,Bcl2蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）,0.1μmol/L和100μmol/L Diplacone组则均无明显变化;10μmol/L Diplacone组的Casepase-9蛋白表达水平显著降低（P<0.05）,0.1μmol/L、1μmol/L和100μmol/L Diplacone组则均无明显变化。（4）Diplacone对HCy诱导的HUVEC Bax、Bcl2、Casepase-3和P53 mRNA表达水平的影响qRT-PCR检测结果显示,与正常对照组比较,HCy模型组促凋亡指标Bax、Casepase-3、P53 mRNA表达水平均显著升高,抑制凋亡指标Bcl2的mRNA表达水平显著降低（P<0.05）。与HCy模型组比较,1μmol/L和10μmol/L Diplacone组的Bax mRNA表达水平均显著降低（P<0.05）,Bcl2 mRNA表达水平均显著升高（P<0.05）,0.1μmol/L和100μmol/L Diplacone组则均无明显变化;10μmol/L Diplacone组的Casepase-3和P53mRNA表达水平均显著降低（P<0.05）,0.1μmol/L、1μmol/L和100μmol/L Diplacone组则均无明显变化。（5）Diplacone对HCy诱导的HUVEC NF-κB蛋白和mRNA表达的影响Western Bloting和qRT-PCR检测结果显示,与正常对照组比较,HCy组的NF-κB蛋白和mRNA的表达水平均显著增加（P<0.05）。与HCy模型组比较,1μmol/L和10μmol/L Diplacone组的NF-κB蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）,0.1μmol/L Diplacone组虽无明显变化,但有降低趋势,100μmol/L Diplacone组则无明显变化;10μmol/L Diplacone组的NF-κB mRNA表达水平显著降低（P<0.05）,0.1μmol/L和1μmol/L Diplacone组虽无明显变化,但有降低趋势,100μmol/L Diplacone组则均无明显变化。提示,0.1¹0μmol/L Diplacone可呈浓度依赖性降低HCy诱导的HUVEC NF-κB蛋白和mRNA表达水平。结论1.本试验条件下,HCy诱导所致HUVEC损伤的最适损伤浓度为2 mmol/L,最适损伤时间为12 h。可诱导内皮细胞损伤,降低细胞的存活率。2.0.1¹0μmol/L Diplacone对2 mmol/L HCy诱导的HUVEC损伤有保护作用。可浓度依赖性地改善细胞形态和胞核凋亡形态,抑制HCy所致细胞凋亡及周期阻滞作用。3.Diplacone可降低2 mmol/L HCy所致培养的HUVEC的VCAM-1、ICAM-1、P-selectin的分泌量、基因和蛋白表达量的增加。4.Diplacone可降低2 mmol/L HCy所致培养的HUVEC ROS的比率及MDA水平,亦升高抗氧化指标SOD、GSH-Px的活性。5.Diplacone可降低2 mmol/L HCy所致培养的HUVEC促凋亡指标Bax、Casepase-9、Casepase-3和P53的mRNA或蛋白表达的升高;增加凋亡抑制指标Bcl2的mRNA和蛋白表达。6.Diplacone可干预2 mmol/L HCy所致培养的HUVEC的NF-κB基因和蛋白的表达增加