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目的研究miR-146a对Th17细胞分化过程和功能的影响并探索可能的调控机制,为调控Th17细胞参与的免疫应答寻找新方法。方法应用磁珠法分选小鼠脾脏CD4+CD25-初始T细胞,流式细胞术检测目的细胞的纯度;应用抗小鼠CD3/CD28单克隆抗体刺激CD4+CD25-初始T细胞活化增殖后,用miR-146a agomir和antagomir试剂转染调控CD4+CD25-初始T细胞中miR-146a表达水平,实验设置为上调组、下调组以及空白对照组,根据课题组前期实验结果,每组分别设置不同转染浓度亚组,并选取最佳转染浓度;根据文献选取3个不同浓度的IL-6、TGF-β、抗小鼠IL-4抗体以及抗小鼠IFN-γ抗体组合诱导CD4+CD25-初始T细胞向Th17细胞方向分化,验证各方案的诱导效果并选取最佳诱导方案;流式检测各组Th17细胞数目并用ELISA方法检测各组细胞培养体系上清中IL-17水平,QRT-PCR和Western-blot方法检测筛选出的miR-146a可能发挥作用的靶基因的转录及蛋白表达水平。结果1.磁珠分选前小鼠脾脏CD4+CD25-初始T细胞的比例为24.9%;磁珠分选后CD4+CD25-初始T细胞纯度为92.3%,细胞活性可达到98%。2.成功转染调控CD4+CD25-初始T细胞中mi R-146a的表达水平,并且成功诱导CD4+CD25-初始T细胞向Th17细胞方向分化。3.用最佳浓度miR-146a调控试剂转染以及最佳浓度诱导后,上调组、下调组与空白对照组相比Th17细胞数目和上清中IL-17水平不同。流式细胞学检测结果提示,上调组较下调组及空白对照组Th17数目显著增多(P<0.01),下调组较空白组Th17细胞数目明显减少(P<0.01);ELISA检测结果显示,上调组较下调组及空白对照组上清中IL-17水平显著升高(P<0.01),下调组较空白对照组上清中IL-17水平明显降低(P<0.01)。4.QRT-PCR和Western blot结果提示,Th17细胞关键转录因子ROR-γt和IL-17基因的mRNA和蛋白表达水平在上调组与下调组和空白对照组相比,明显升高(P<0.01),在下调组显著降低(P<0.01);STAT1的表达水平在各组无明显差异(P>0.05);IRAK1表达水平在上调组较下调组和空白组明显增高(P<0.01);在下调组中其表达水平明显降低(P<0.01)。结论1.CD4+CD25-初始T细胞中mi R-146a的表达水平与Th17细胞的分化及其分泌的IL-17水平呈平行关系,miR-146a表达上调可以促使Th17细胞数目及IL-17分泌量增多;而miR-146a的表达下调后,Th17细胞数目以及IL-17分泌量也显著降低。2.在Th17参与的炎性环境中,调控miR-146a表达水平后,其靶基因之一STAT1的表达水平无显著变化;miR-146a与另一个靶基因IRAK1不再是负性调控关系,miR-146a表达上调后,IRAK1的表达水平也随之升高,这可能与促进Th17细胞的分化及其分泌IL-17能力的有关。