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为了提高肺癌的生存率，寻找特异性好，敏感度高的肿瘤标志物一直是临床研究的重要课题之一。循环DNA是存在于血液（血浆或血清）、滑膜液等体液中的游离DNA，已被广泛应用于基因诊断。杂合性缺失（LOH）是肺癌的频发事件，本课题的研究主要通过测定血浆循环DNA的LOH，以观察循环DNA 的LOH作为一种肿瘤标志物在肺癌诊断上的作用。我们的工作包括以下两个方面：一、建立血浆循环DNA的提取方法 分别用酚/氯仿提取法、柱提取法和煮沸法三种方法提取10例血浆标本中的循环DNA，用琼脂糖电泳观察方法能否成功提取循环DNA，并用紫外分光光度法测定其含量和纯度。 结果酚/氯仿提取法、柱提取法和煮沸法分别有10例、10例和4例标本提取的循环DNA可见电泳条带。酚/氯仿提取法提取血浆循环DNA的含量为127±87.9ng/ml，柱提取法为133±88.9ng/ml，煮沸法提取出DNA的含量用紫外分光光度法几乎不可测。三者提取含量经方差分析：差别具有显著性意义（p<0.01），两两比较酚/氯仿提取法、柱提取法之间差别无<WP=8>显著性（p>0.05），而均与煮沸法有极显著的差别（p<0.01）。酚/氯仿提取法OD260/OD280D比值的均值为1.76 ± 0.12，柱提取法为1.68±0.12，二者经t检验， 差别无显著性意义（p>0.05）。 并以所提取的DNA进行了内参照物β2-微球蛋白的PCR， 观察所提取的DNA是否适合作为PCR反应的模板。酚/氯仿提取法、柱提取法基本能从所有标本中提取出循环DNA，进行PCR的效果较为满意，而煮沸法只有4例标本可进行PCR。三种方法中酚/氯仿提取法所提取的循环DNA的质量和含量都最好，柱提取法次之，煮沸法最差。据此，确定了酚/氯仿提取法作为本研究采用的提取DNA的方法。二、循环DNA杂合性缺失作为肿瘤标志物在肺癌诊断上的意义共收集了69例初诊的肺癌患者（后均经病理细胞学确诊）在治疗前的全血标本以及对应组织标本，40例非肺癌肺科住院病人也抽取全血标本，用酚/氯仿提取法提取相应的血浆或组织DNA，并测定了血浆循环DNA的含量。肺癌患者和对照中均含有循环DNA，前者的含量为494±345ng/ml，后者的含量为28±12ng/ml，二者具有十分显著的差异（p<0.01），肺癌患者的血浆循环DNA的含量升高。选取了D3S1300、D3S1289、D13S171和D17S2179E四个杂合度较高（>95%）的微卫星位点，以PCR-银染法对69例肺癌患者血浆循环DNA和肿瘤组织DNA及对照的血浆循环DNA进行了这四个位点的LOH分析。在69例肺癌患者中，肿瘤DNA的D3S1300位点 LOH检出率为40.6%，D3S1289位点LOH为31.9%，D13S171位点LOH<WP=9>为33.3%，D17S2179E位点为15.9%，在其相应的血浆中分别有20例检出D3S1300位点 LOH, 检出率为29.0%； 17例检出3S1289位点LOH，检出率为 24.6%；14例检出D13S171位点 LOH, 检出率为20.3%； 8例检出D17S2179E 位点LOH， 检出率为11.6%， 肿瘤组织与血浆DNA的LOH 的阳性率存在显著性差异（p<0.05）。 对照组血浆 DNA各有2例、3例、2例和0例血浆中检出D3S1300位点、D3S1289位点、D13S171位点和D17S2179E位点 LOH，与肺癌组的血浆DNA 的LOH比较具有显著性差别（p< 0.01）。以上结果说明血浆循环DNA存在与原发肿瘤相同的基因改变，可与肿瘤组织DNA一样作为肿瘤标志物。血浆循环DNA诊断肺癌的效率和所选择的基因有关。血浆循环DNA D3S1300位点、D3S1289位点、D13S171位点和D17S2179E位点的LOH诊断肺癌的特异度和敏感度分别为95%和29.0%，92.5%和24.6%，95%和20.3%，97.5%和11.3%。血浆循环DNA 的D3S1300位点， D13S171位点的LOH与非小细胞性肺癌（NSCLC）的相关性较大；而D3S1289位点LOH与小细胞性肺癌（SCLC）相关性较大；D17S2179E在二者之间差别不大。以>20ng/ml作为阳性判断标准， 癌胚抗原（CEA）诊断肺癌的特异度和敏感度为90.0%和29.0%。与CEA相比，循环DNA单个微卫星位点LOH特异度较高，但敏感度并无优越性，有的甚至低于CEA。血浆DNA微卫星标志的联合应用可提高对肺癌的诊断效率，以一<WP=10>个位点出现LOH阳性为诊断标准，微卫星位点联合应用诊断肺癌的效率如下：D3S1300位点+D3S1289位点LOH诊断肺癌的特异度和敏感度分别为87.5%和49.3%； 循环DNA D13S171位点+D3S1289位点LOH为85.0%和37.7%；循环DNA D3S1300位点+D3S1289位点+D17S2179E位点LOH为85.0%和56.2%；循环DNA D13S171位点+D3S1289位点+D17S2179E位点LOH为82.5%和46.4%； 循环DNA D3S1300位点+D13S171位点+D17S2179E位点为82.5%和50.7%； 四个位点联合诊断肺癌的特异度为72.5%，敏感度为65.2%。循环DNA和CEA联合应用诊断肺癌的效率如下：D3S1300位点LOH+CEA的特异度和敏感度分别为87.5%和50.7%，D3S1289位点LOH+CEA为87.5%和42.0%，D3S1300位点LOH+D3S1289位点LOH+CEA为82.5%和66.7%，四个位点的LOH+CEA为77.5%和78.2%。由以上结果可以看出D3S1289位点LOH+D3S1300位点LOH以及D3S1289位点LOH+D3S1300位点LOH+CEA的组合方式较好。循环DNA LOH对肺癌具有一定的辅助诊断价值，还不能完全满足临床的需要，需要进一步提高检测方法的特异度和灵敏度，以及寻找更特异的标志物。