论文部分内容阅读
聚γ-谷氨酸(poly-γ-glutamicacid,简称y-PGA)是一种由微生物合成的高分子聚合物,其具有絮凝、保湿、可食用、可生物降解等特性,在环保、化妆品、食品、医药和农业等领域具有广泛的应用价值。目前γ-PGA发酵培养基需添加大量外源谷氨酸,导致γ-PGA发酵成本较高,限制其工业化生产。本研究的目的是探索一条γ-PGA高效从头合成(由葡萄糖在胞内经过一系列转化反应合成γ-PGA)的发酵工艺,以及挖掘碱胁迫促进γ-PGA从头合成的关键效应基因。以地衣芽胞杆菌WX-02(简称WX-02)为γ-PGA发酵菌株,在无外源谷氨酸添加的培养基中进行了碱胁迫强度优化实验,确定初始pH 9.0为碱胁迫促进γ-PGA合成的最优条件,并在该碱胁迫条件下优化了 γ-PGA从头合成培养基,优化结果为葡萄糖 80 g/L,柠檬酸钠 30 g/L,NH4C1 8 g/L,NaN03 15 g/L,K2HPO4·3H20 1 g/L,MgS04.7H20 1 g/L,ZnS04.7H20 1 g/L,CaC12 1 g/L,MnS04 H20 0.15 g/L。利用从头合成培养基进行γ-PGA发酵,碱胁迫组y-PGA产量为33.56 g/L,相对非碱胁迫组(21.95 g/L)y-PGA 产量提高了 52.89%。在50 L发酵罐中探索了碱胁迫对y-PGA发酵的影响,碱胁迫组y-PGA产量达到了 36.26 g/L,相比对照组提高了 79%,y-PGA合成酶基因pgsB和pgsC以及其转录调控因子degU和swrA相对表达量分别提高为对照组的19.9倍、32.2倍、4.0倍和7.3倍,γ-PGA发酵过程中代谢副产物乙偶姻和2,3-丁二醇的积累量分别减少为8.01 g/L和9.56 g/L,相比对照组降低了 46.28%和21.96%。对比与谷氨酸(y-PGA合成的前体物质)合成相关基因转录水平发现,碱胁迫组柠檬酸合成酶基因citZ和异柠檬酸脱氢酶基因icd的相对表达量分别上调为对照组的1.69倍和2.09倍,而α-酮戊二酸脱氢酶基因ogdH和二氢硫辛酰琥珀酰转移酶基因odhB的相对表达量下调为对照组的0.44倍和0.66倍,说明谷氨酸合成路径被强化。同时,碱胁迫组RQ值显著高于对照组,厌氧调节因子fnr·转录水平提高为对照组的4.96倍,说明碱胁迫增强了菌体的硝酸盐呼吸。以上结果表明,碱胁迫增强γ-PGA合成的机制涉及如下方面:碱胁迫可提高γ-PGA合成酶的表达,改变菌体的碳代谢流分布,增强谷氨酸底物的合成,抑制代谢副产物乙偶姻和2,3-丁二醇的生成,促进菌体硝酸盐呼吸,提高菌体在供氧不足情况下的能量供应,从而促进γ-PGA的合成。以motA、yhbj、degU和swrA为候选基因,从中筛选碱胁迫促进y-PGA增产的关键效应基因,研究发现,motA和yhbJ对γ-PGA的合成无显著影响。degU强化表达菌株的γ-PGA产量在非胁迫培养基中为32.79 g/L,显著高于转化空质粒菌株(27.06 g/L),而在碱胁迫培养基中为42.05 g/L与转化空质粒菌株(41.12 g/L)无显著差别,说明degU可能为碱胁迫增强y-PGA合成的关键效应基因之一。swrA缺失菌株和强化表达菌株的γ-PGA产量分别为1.30 g/L和2.31 g/L,均显著低于野生菌株(22.21 g/L),证明SwrA在γ-PGA合成过程中起着不可或缺的作用,同时SwrA与γ-PGA合成之间存在着强烈的剂量效应关系,但依靠目前的实验结果尚无法判定swrA是否为碱胁迫增强γ-PGA从头合成的关键效应基因。