造血功能障碍是恶性肿瘤化学药物治疗和大剂量放射线治疗、放射源意外泄漏和核战争条件下急性放射损伤的主要并发症之一。其中,巨核细胞损伤导致的血小板减少除输注血小板外,尚缺乏有效的治疗手段。血小板生成素(thrombopoietin,TPO)作为刺激巨核细胞增殖和血小板生成的重要细胞因子仍存在治疗后产生抗凝血抗体、加重出血的危险性。如何安全有效地促进血小板数量和功能的恢复,尚需探索。造血微环境(hematopoietic inductive microenvironment,HIM)是支持和调节造血细胞生长发育的内环境,具有促进巨核细胞增殖分化、成熟产板的作用。因此,从修复或重建骨髓造血微环境正常功能入手治疗巨核细胞损伤,是一个值得探索的领域。骨髓基质细胞(human bone marrow stromal cells,hBMSCs)是造血微环境的主要成分,自1977年Dexter在体外培养出骨髓基质细胞获得成功后,人们对BMSCs进行了深入的研究。目前,骨髓基质细胞体外培养扩增联合造血干细胞回输经实验和临床验证是重建造血功能损伤的有效方法。由于自体移植中患者自身造血微环境异常,而异体移植又存在组织相容性的问题,限制了骨髓基质细胞在临床上的广泛运用。人脐血中的细胞成分丰富且较骨髓和外周血更原始,具有来源广泛,采集方便,免疫原性弱和长期造血重建的特点,已成为新的造血干细胞来源。本课题组长期从事人脐血源基质细胞(human umbilical cord blood-derived stromal cells,hUCBDSCs)及脐血造血微环境的研究,前期研究经体外培养扩增获得hUCBDSCs,证明其具备造血基质细胞的基本特征和造血调控功能的物质基础,以hUCBDSCs为滋养层的体外扩增体系促进巨核细胞集落(colony forming unit-megakaryocte,CFU-Meg)形成的作用明显优于hBMSCs,提示hUCBDSCs在促进巨核细胞增殖分化方面可能具有特殊的意义,对其作用特点和机制的深入研究可为巨核细胞损伤修复治疗提供新的思路。鉴于此,本课题在构建巨核细胞/hUCBDSCs共培养模型和裸鼠造血微环境损伤模型的基础上,观察hUCBDSCs体外促进巨核细胞增殖和体内重建造血微环境、促进巨核细胞生成和血小板数量恢复的作用。从TPO途径、SDF-1途径和间隙连接细胞间通`讯三个方面深入探讨hUCBDSCs促进巨核细胞增殖和移植裸鼠血小板恢复的可能机制,为安全有效促进血小板功能和数量恢复提供新的辅助治疗措施。方法:1.观察人脐血源基质细胞促进巨核细胞系HEL增殖的体外研究实验分组:①HEL细胞悬浮培养组;②HEL细胞/hBMSCs共培养组;③HEL细胞/hUCBDSCs共培养组。倒置显微镜和扫描电镜观察HEL细胞和基质细胞的位象关系;CCK8法绘制HEL细胞生长曲线;流式细胞仪检测HEL细胞的细胞周期和凋亡坏死情况,透射电镜观察HEL细胞超微结构。2.观察人脐血源基质细胞移植重建造血微环境促进巨核细胞生成的在体研究对裸鼠实施不同辐照剂量照射,观察裸鼠辐照后不同时相点血象、骨髓象、CFU-F等指标变化,探索适宜本研究的造血微环境损伤动物模型的辐照剂量。根据上述实验结果,选定5.0Gy作为造血微环境损伤动物模型的辐照剂量;实验分组:①生理盐水组;②hBMSCs组;③hUCBDSCs组。观察不同移植组造血微环境重建和巨核细胞、血小板数量恢复情况。动态观察CM-DiI标记hUCBDSCs裸鼠体内迁移情况。3.人脐血源基质细胞促进巨核细胞增殖的机制研究3.1 TPO途径在人脐血源基质细胞促进巨核细胞增殖中的作用ELISA法动态检测hBMSCs和hUCBDSCs培养上清TPO浓度;激光共聚焦、流式细胞仪检测不同培养条件下HEL细胞C-mpl蛋白表达,RT-PCR检测HEL细胞C-mpl mRNA表达水平。3.2 SDF-1途径在人脐血源基质细胞促进巨核细胞增殖中的作用ELISA法动态检测hBMSCs和hUCBDSCs培养上清SDF-1浓度;激光共聚焦、流式细胞仪检测不同培养条件下HEL细胞CXCR4蛋白表达,RT-PCR检测HEL细胞CXCR4 mRNA表达水平。3.3间隙连接细胞间通讯在人脐血源基质细胞促进巨核细胞增殖中的作用荧光漂白恢复(FRAP)技术检测细胞间通讯功能;激光共聚焦显微镜观察共培养条件下HEL细胞和hUCBDSCs Cx43蛋白表达;RT-PCR法检测共培养条件下HEL细胞和hUCBDSCs Cx43 mRNA水平表达情况。透射电镜观察共培养条件下HEL细胞和hUCBDSCs细胞连接处超微结构。结果:1.倒置显微镜观察,HEL细胞粘附在hUCBDSCs表面,呈球形,随培养时间的延长,HEL细胞数量逐渐增多;扫描电镜观察发现HEL细胞可通过伪足粘附于hUCBDSCs表层,或龛于hUCBDSCs融合所形成的“网眼”中,甚至移行到hUCBDSCs层下,部分hUCBDSCs胞膜突起与多个HEL细胞粘附,形成“放射状”排列。HEL细胞生长曲线显示HEL/hUCBDSCs组细胞生长速度最快;细胞周期结果显示HEL/hUCBDSCs组S+G2/M期细胞比例最高(P<0.05),突显出hUCBDSCs在巨核细胞增殖中的特殊促进作用。凋亡率结果显示三组之间无显著性差异(p>0.05)。2.裸鼠接受不同剂量辐照所表现出来的血象变化程度不同,5.0Gy组裸鼠有明显骨髓抑制和CFU-F计数降低,且在照射后自行恢复,是裸鼠造血微环境损伤的理想辐照剂量。移植裸鼠实验结果显示:基质细胞有明显的促进血小板恢复的作用,其中hUCBDSCs作用最强。采用CM-DiI标记hUCSDCs移植裸鼠,激光共聚焦显微镜观察发现:hUCSDCs在肝脏、脾脏和肺脏组织间隙短暂“停留”后,迅速“归巢”至骨髓重建损伤造血微环境。3.人脐血源基质细胞促进巨核细胞增殖的机制研究3.1 ELISA检测结果显示hUCBDSCs分泌表达TPO水平明显高于hBMSCs,分泌高峰稍迟于hBMSCs,传代后hUCBDSCs培养上清中的TPO浓度仍高于hBMSCs。流式细胞仪和激光共聚焦检测均显示其C-mpl蛋白的表达明显增强;RT-PCR检测不同培养条件下HEL细胞C-mpl mRNA表达情况,结果显示无显著性差异;3.2 ELISA结果显示:体外液体培养前6天,hUCBDSCs和hBMSCs SDF-1分泌水平相当,6天后hUCBDSCs SDF-1分泌水平明显高于hBMSCs,传代后hUCBDSCs培养上清中的SDF-1浓度仍高于hBMSCs;流式细胞仪和激光共聚焦检测均显示与hUCBDSCs和hBMSCs共培养的HEL细胞CXCR4蛋白表达明显减弱,且可在部分HEL细胞胞浆中发现红色点状荧光;RT-PCR检测不同培养条件下HEL细胞CXCR4 mRNA表达情况,结果显示无显著性差异;3.3在本试验条件下,荧光漂白恢复技术检测结果提示hUCBDSCs和HEL细胞之间无明显荧光物质交换,而相互粘连的hUCBDSCs的荧光强度在淬灭后荧光迅速恢复;激光共聚焦显微镜观察共培养条件下HEL细胞Cx43表达较弱,呈均匀分布,hUCBDSCs Cx43表达较强,可见呈点状群聚分布的高亮斑块;RT-PCR检测在HEL/hUCBDSCs共培养体系中,HEL细胞Cx43 mRNA的表达明显低于hUCBDSCs。结论:1.人脐血源基质细胞具有促进巨核细胞增殖的作用:①生长曲线――细胞扩增速度加快;②细胞周期――S+G2/M期细胞比例明显增多;③扫描电镜――可见hUCBDSCs粘附、龛合、包裹HEL细胞;④透射电镜――可见大量增殖旺盛的HEL细胞和核分裂相;2.人脐血源基质细胞具有重建移植裸鼠造血微环境和促进巨核细胞和血小板数量和功能恢复的作用;3. hUCBDSCs通过分泌高水平TPO,上调巨核细胞C-mpl蛋白的表达,促进巨核细胞增殖、分化、产板;4. hUCBDSCs通过分泌高水平SDF-1,促进巨核细胞的迁移和增殖,在迁移的过程中巨核细胞表面CXCR4表达降低,形成“内吞小泡”,调控巨核细胞的迁移;5.本试验条件下,hUCBDSCs和HEL细胞间未检测到间隙连接细胞间通讯,提示GJIC功能对hUCBDSCs促进巨核细胞增殖的作用不明显。