小麦F-box蛋白基因TaFBA1的分离与功能分析

来源 :山东农业大学 | 被引量 : 3次 | 上传用户:inspisee1999
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小麦是禾本科小麦属的重要栽培作物,也是我国第二大粮食作物。全世界约有35%-40%的人口以小麦作为主要粮食。小麦生长过程中经常遭受干旱胁迫的危害而导致减产。干旱胁迫导致植物体内蛋白质损伤,细胞内无功能蛋白的积累增多,多种酶受到影响造成一系列生理生化代谢过程紊乱,甚至导致细胞、组织、器官或者植株的死亡。因此,胁迫条件下无功能蛋白质的及时清除成为植物抵抗逆境的重要机制,而泛素-26S蛋白酶体系统在清除这些无功能蛋白过程中起着至关重要的作用。泛素连接酶E3是泛素-26S蛋白酶体系统的关键酶,其中F-box蛋白是多亚基泛素连接酶E3的关键亚基,也是识别底物蛋白的特异组分,在泛素-26S蛋白酶体系统中居于关键部位。前人研究发现F-box蛋白在植物抗逆性中起着重要作用。本研究从抗旱小麦品种山农16中获得了泛素连接酶SCF复合体F-box亚基基因TaFBA1及其启动子区域,对其序列特征、表达模式进行了分析,构建了组成型和胁迫诱导型表达载体,转化烟草和拟南芥获得了转基因植株,对转基因植株的抗逆性及其生理机制进行了研究。主要结果如下:(1)利用同源克隆从小麦中分离到F-box基因TaFBA1(JN038382)。该基因cDNA全长为1334bp,基因的开放阅读框编码325个氨基酸,分子量约为36.6kDa,具有两个保守区F-box结构域和AMN1(Antagonist of mitotic exit network protein1)结构域。(2)利用Tail-PCR分离了TaFBA1基因的启动子区域(JQ065654),长度为1104bp;PlantCARE功能软件预测表明,该启动子区域含有茉莉酸甲酯、水杨酸、乙烯缺氧胁迫、胚乳表达、伤口、植物防御与抗性等响应元件以及参与干旱诱导的MYB结合位点。(3)将p35S-TaFBA1-GFP融合蛋白在洋葱表皮中瞬时表达。通过荧光显微镜观察到TaFBA1-GFP融合蛋白在细胞膜、细胞质和细胞核中都有分布。(4)qRT-PCR分析表明,TaFBA1基因在根、茎、叶、小穗中均有表达,其中叶片中表达最丰富,茎中最低。PEG、NaCl、MV等逆境胁迫条件均能诱导该基因的上调表达,同时外施ABA、MeJA、SA、ETH等激素也可诱导TaFBA1基因的上调表达。(5)构建了基因的原核表达载体pET-TaFBA1,并在大肠杆菌BL21中表达了融合蛋白。将诱导蛋白分离纯化并溶于PBS中获得抗原,免疫小白鼠制备了抗体。检测抗血清效价为1:1500。Western杂交表明,干旱诱导小麦叶片中TaFBA1蛋白的表达丰度提高。(6)将获得的TaFBA1基因编码序列与含有35S启动子的pBI121载体重组,构建了过表达载体pBI121-35S-TaFBA1。利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,获得过表达TaFBA1的转基因烟草植株。利用农杆菌介导的花序侵染法转化拟南芥,获得了过表达TaFBA1的拟南芥转基因植株。利用PCR对带卡那抗性的转基因烟草和拟南芥植株进行检测,结果证明成功地获得了过表达TaFBA1烟草和拟南芥植株。Western blot同样证实转基因烟草株系中TaFBA1蛋白的表达明显。(7)选择3个过量表达TaFBA1的转基因株系用于基因抗逆性功能研究。结果表明,干旱胁迫下过表达TaFBA1烟草植株比野生型植株萌发率较高,萌发较快;过表达TaFBA1烟草幼苗比野生型叶片数较多,侧根数较多,生长量较高,说明过表达TaFBA1提高了烟草的抗旱能力,维持了较好的生长势。干旱胁迫下,过表达TaFBA1烟草比野生型植株积累较少的ROS,相对电导率较低,丙二醛含量较少,说明过量表达TaFBA1基因在一定程度上缓解了干旱胁迫导致的活性氧胁迫,细胞受伤害程度较低,细胞膜完整性较好,膜透性受影响较小。干旱胁迫下过表达TaFBA1烟草比野生型植株相对含水量较高,气孔开度较大,光合速率较强,说明转基因植株根系发达,吸水能力强,维持较好的水分状况,从而能够维持较高的光合速率,增强了叶片的耐干旱能力。(8)检测了转基因植株的耐氧化胁迫能力。MV处理条件下,过表达烟草种子比野生型具有较高的萌发率;转基因幼苗失绿、根系受抑制程度较轻,生长情况较好;表明过表达TaFBA1的转基因烟草抗氧化胁迫能力较强。用MV处理叶圆片后发现,转基因株系相比野生型植株叶绿素含量较高,相对电导率较低、丙二醛含量较少,抗氧化酶SOD、POD、APX、CAT活性高且较稳定,积累ROS较野生型少,细胞受伤害程度较小,说明转基因烟草的抗氧化胁迫能力较强。进一步检测氧化胁迫相关基因表达发现,在正常情况和MV处理条件下,过表达TaFBA1均影响了氧化胁迫相关基因的表达。(9)观察了转基因株系整个生育期的生长发育表型。与野生型烟草相比,过表达TaFBA1转基因烟草叶片畸形率较高。同时发现,过表达TaFBA1转基因拟南芥比野生型生长减缓,植株矮小,叶片呈现明显皱缩,缺刻增多。(10)为了减轻过表达TaFBA1基因对植株表型造成的影响,同时保持TaFBA1基因的耐逆性功能,我们用胁迫诱导启动子RD29A代替35S启动子,构建了胁迫诱导表达载体pBI121-RD29A-TaFBA1,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,获得胁迫诱导表达TaFBA1烟草植株。对诱导型转基因植株的初步观察研究发现,干旱和氧化胁迫条件下,胁迫诱导表达TaFBA1转基因烟草植株比野生型烟草的耐干旱和耐氧化胁迫能力较强,表型与野生型差异不明显。以上研究表明,TaFBA1基因不仅在植物抵抗干旱胁迫和氧化胁迫时具有重要作用,而且还可能与植物的生长发育相关。
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